Презентация / ЛукашеваЕВ_лек_ферменты_мед_сайт(очистка)

Методы разделения и очистки белков

Физико-химические свойства белков

Молекула имеет большое количество (+) и (-) заряженных групп на поверхности

При большинстве значений рН она заряжена, поэтому электрофоретически подвижна

Изоэлектрическая точка – это значение рН, при котором суммарный заряд равен 0, поэтому белок не двигается в эл.поле

Белки – амфотерные электролиты

Молекула окружена гидратной и сольватной оболочками (молекулы воды и ионы металлов ориентируются вокруг зарядов белка)

Растворы белков поглощают УФ (ультрафиолетовый цвет)

Белки термолабильны

Почему важно отделить белок от других молекул?

Потому что только при наличии гомогенного белка возможно изучать

его свойства!

Преподготовка материала

Гомогенизация тканей

Разрушение клеток осмотическим лизисом (пониженное содержание солей в растворе), лизоцимом, ультразвуком, механическим воздействием.

Солюбилизация белков (перевод в растворимое состояние) – соли, детергенты, рН, органические растворители (могут денатурировать белок)

После разрушения клеток грубый лизат можно отделить от клеточных мембран фильтрованием или центрифугированием. Целевой белок находится в растворе

Принципы разделения молекул

1.По растворимости

2.По молекулярной массе (М.М.)

3.По заряду

4.По гидрофобности

5.По специфическому сродству (аффинности)

Высаливание (фракционированное осаждение белков) не специфичный метод, который в связи с большим объемом материала используют на начальных стадиях разделения белков

При рН, близких к изоэлектрической точке, белки наименее растворимы

При удалении рН от изоэлектрической точки растворимость белка повышается.

Заряды препятствуют взаимодействию молекул белка с последующим образованием агрегатов и преципитации.

Оптимальное условие преципитации (высаливания белков) – изоэлектрическая точка.

Зависимость растворимости - лактоглобулина от pH при различных концентрациях NaCl

Растворимость β-лактоглобулина наименьшая вблизи изоэлектрической точки (рI 5,2)

Изоэлектрические точки некоторых белков

Page 133

Диализ

— очистка высокомолекулярных веществ от низкомолекулярных соединений при помощи

полупроницаемой мембраны.