Полимеразная цепная реакция

Рис. 17. Схема ПЦР «в реальном времени» с пробами-«скорпионами». Для упрощения из схемы исключены образующиеся при денатурации одноцепочечные молекулы ДНК, не связывающиеся с пробой. Ф – флуорофор, Г – гаситель флуоресценции.

Мультиплексная ПЦР

Мультиплексная ПЦР является разновидностью ПЦР «в реальном времени» с меченными флуорофорами пробами, которая позволяет одновременно проводить в одной пробирке несколько реакций ПЦР и выявлять НК сразу нескольких возбудителей. Например, существуют тест-системы для выявления различных типов вирусов гриппа (А, В и С), для выявления основных возбудителей ОРВИ и т.д. При проведении мультиплексной ПЦР используются сразу несколько флуорофоров, причем проба для выявления НК каждого из возбудителей помечена определенным красителем. Флуорофоры дают излучение разной длины волны, что позволяет детектирующей камере их дифференцировать. Как правило, в составе детектирующей камеры есть набор автоматически сменяемых светофильтров, пропускающих излучение с разной длиной волны, что позволяет одновременно отслеживать несколько реакций в одной пробирке. Флуорофоры для разных проб должны давать излучение с существенно различающейся длиной волны, чтобы детектирующая камера могла их дифференцировать. По этой причине количество флуорофоров, и соответственно, количество видов микроорганизмов, которых можно одновременно выявить в реакции, ограничено 7-8.

Количественная ПЦР

В ряде случаев выявления НК возбудителя в исследуемом материале оказывается недостаточно и требуется определить также ее количество. Например, при оценке характера течения ВИЧ-инфекции, а также при оценке эффективности антиретровирусной терапии часто используется показатель вирусной нагрузки. Этот показатель обычно оценивается по количеству вирусных РНК в единице объема сыворотке крови больного. В таких случаях используется количественная ПЦР.

Оценка количества молекул НК микроорганизма возможна при использовании ПЦР с ЭФ детекцией, однако такой способ технически сложен и трудоемок, поэтому гораздо чаще используют количественную ПЦР «в реальном времени».

Для количественной ПЦР «в реальном времени» используют стандартный образец (стандарт) – раствор, содержащий готовые ампликоны в известной концентрации. Сначала готовят серию десятикратных разведений стандарта, после чего ставят реакции ПЦР «в реальном времени» как с полученными разведениями, так и с исследуемым образцом (рис. 18).

Рис. 18. Количественная ПЦР «в реальном времени». На графике представлены кривые, образуемые стандартными образцами с концентрацией от 107 (крайняя левая кривая) до 10 молекул НК (крайняя правая кривая), а также кривая, образованная исследуемым образцом. Пороговый цикл реакции (Ct) для каждой кривой соответствует точке пересечения ей порога флуоресценции.

По завершении ПЦР «в реальном времени» с разведениями стандартного образца формируется график с кривыми флуоресценции разведений стандартного образца и исследуемого образца. Далее устанавливается определенный порог

флуоресценции и определяется пороговый цикл реакции (Ct) для всех полученных кривых. Пороговый цикл реакции – цикл амплификации, на котором интенсивность флуоресценции достигает заданного порогового уровня, т.е. точка, где кривая флуоресценции пересекает порог флуоресценции.

По полученным значениям Ct строится калибровочный график, где по оси Х откладываются концентрации ампликонов в разведениях стандартного образца (в логарифмическом масштабе), а по оси Y – соответствующие им значения Ct. С помощью калибровочного графика определяется концентрация НК микроорганизма в исследуемом образце по значению его Ct (рис. 19).

Рис. 19. Калибровочный график для количественной ПЦР. Маленькие крестики соответствуют разведениям стандартного образца, по ним строится калибровочная линия. Большой крестик соответствует положению на калибровочной линии исследуемого образца, по которому определяют количество содержащейся в нем НК.

ПЦР С ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ ПО КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ

Данный тип ПЦР по своему механизму ничем не отличается от ПЦР «в реальном времени» и также предполагает использование интеркалирующих флуоресцирующих красителей или флуоресцирующих красителей в составе контрольных праймеров-проб и учет результата реакции по уровню флуоресценции. Различие заключается лишь в способе детекции результата реакции: ПЦР с флуоресцентной детекцией по конечной точке проводится в обычных амплификаторах (без детектирующей камеры). По завершении реакции производится учет уровня флуоресценции реакционной смеси с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора (рис. 20). Результат реакции считается положительным в том случае, если уровень флуоресценции реакционной смеси по