LS-Sb88916
.pdf
активного вещества, толщины сдоя вещества, температуры и длины волны света. Обычно определение угла оптического вращения углеводов проводят при t = 20 ° С и при длине волны линии «D» спектра натрия 589.3 нм.
Для сравнительной оценки способности различных веществ вращать плоскость поляризации вычисляют удельное вращение. Удельным вращением называется вращение плоскости поляризации, вызванное слоем вещества толщиной 1 дм при пересчете на содержание 1 г вещества в 1 мл объема. Если удельное вращение определяют при длине волны «D» спектра и при 20 ° С, то
его обозначают знаком [α]20D .
Удельное вращение растворов определяют по формуле
[α]20D = a ×100 ,
IC
где α – измеряемый угол вращения; I – толщина слоя жидкости, дм; С – концентрация раствора, выраженная в граммах вещества на 100 мл раствора.
В интервале концентраций, при которых удельное вращение постоянно, можно по углу вращения рассчитать концентрацию вещества в растворе. Для этого пользуются формулой
C = a ×100 . [α]20D I
Измерения могут быть упрощены при наличии калибровочного графика, отражающего зависимость удельного вращения сахара от его концентрации.
Исследуемый материал: раствор декстрана или глюкозы. Оборудование: поляриметр; пробирки; пипетки; кювета для поляриметра.
Ход работы. В пипетку отобрать 10 мл раствора и перенести в поляриметрическую кювету. Поместить кювету в поляриметр и измерить оптическое вращение заданного раствора полисахарида в градусах (показания на шкале прибора).
Для упрощения определения концентрации сахара строится калибровочная кривая в координатах:
–по оси абсцисс – концентрация сахара в процентах;
–по оси ординат – величина оптического вращения в градусах.
С помощью калибровочной кривой по величине измерительного оптического вращения определяют концентрацию сахара в данной пробе.
Практическая значимость работы. Метод поляриметрии имеет широкое применение в лабораторной практике для определения концентрации ами-
21
нокислот, углеводов и т. д.; в клинической практике – для оценки содержания сахара в биологических жидкостях; в пищевой промышленности – при производстве сахара и изделий из него.
Лабораторная работа 5
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕВИНЫ
ВМОЧЕ ЦВЕТНОЙ РЕАКЦИЕЙ
СПАРА-ДИМЕТИЛАМИНОБЕНЗАЛЬДЕГИДОМ
Цель работы. Освоение колориметрического метода количественного определения мочевины в моче по цветной реакции с пара-диметиламино-
бензальдегидом (пара-ДМАБА), ознакомление с клинико-диагностическим значением этого теста.
Принцип метода. Мочевина, взаимодействуя с пара-ДМАБА, в кислой среде образует соединение, окрашенное в желто-зеленый цвет, интенсивность которого определяют фотоэлектроколориметром:
Исследуемый материал: моча.
Ход работы. К 1 мл мочи, предварительно отфильтрованной и разведенной в 100 раз, добавляют 5 мл 2 %-го пара-ДМАБА и тщательно перемешивают. Параллельно готовят контрольную пробу (одну на подгруппу студентов), содержащую 2 мл Н2О и 10 мл 2 %-го раствора пара-ДМАБА. По истечении
15 мин после постановки опытной пробы проводят ее колориметрирование и сравнивают результат с результатом колориметрирования контрольной пробы на фотоэлектроколориметре при длине волны 440 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Содержание мочевины в моче [г/сут] рассчитывают по формуле
m = (C ×100 ×1500)
1000,
где С – содержание мочевины в 1 мл разведенной в 100 раз мочи, определенное по калибровочному графику, мг; 100 – степень разведения мочи; 1500 – среднесуточное количество мочи, г.
22
Обычно мочевина выводится из организма человека с мочой в количестве
20...35 г/сут. В норме массовое содержание (2…3) × 10–2 %.
Практическая значимость работы. Определение мочевины в моче важно для характеристики состояния белкового обмена организма, функции печени и почек. Повышенное содержание мочевины в моче отмечается при злокачественной анемии, гиперпротеиновой диете, после приема салицилатов, хинина, при отравлении фосфором; пониженное – при уремии, нефрите, острой дистрофии печени, прогрессирующем циррозе. В двух последних случаях страдает мочевинообразующая функция печени.
Лабораторная работа 6
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ В КРОВИ
Цель работы. 1. Освоение колориметрического метода Умбрайта количественного определения пировиноградной кислоты (ПВК) в крови.
2.Определение того, что массовое содержание пировиноградной кислоты
внорме в крови составляет (0.8…0.1) × 10–3 %. С мочой за сутки выделяется
10...25 мг кислоты.
Принцип метода. Метод основан на возникновении красно-розового окрашивания при добавлении раствора щелочи к экстракту, содержащему 2.4-динитрофенилгидразон пировиноградной кислоты, образовавшейся при взаимодействии ПВК с раствором 2.4-динитрофенилгидразина (2.4-ДНФГ):
Пировиноградная 2.4-ДНФГ |
2.4-динитрофенилгидразон |
кислота |
ПВК |
Исследуемый материал: кровь.
Реактивы: трихлоруксусная кислота, 10 %-й раствор; 2.4-ДНФГ, 0.1 %-й раствор; 3 %-й раствор NaOH.
23
Ход работы. В пробирку центрифуги помещают 0.5 мл крови и прибавляют 2 мл 10 %-й трихлоруксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и ставят в ледяную баню. Через 5 мин, после осаждения белков, центрифугируют при 5000 об./мин в течение 5 мин, затем центрифугат сливают в чистую химическую пробирку. К 0.5 мл центрифугата прибавляют 0.5 мл 3 %-го раствора NaOH, выдерживают 5 мин при комнатной температуре, добавляют 0.15 мл 0.1 %-го раствора 2.4-ДНФГ. Содержимое пробирки встряхивают и помещают в термостат при 38 ° С на 15 мин. По истечении этого времени к исследуемой пробе добавляют 3.5 мл 3 %-го раствора NaOH, через 5 мин ее колориметрируют и сравнивают результат с результатом колориметрирования контрольной пробы, которую готовят аналогично опытной пробе, заменяя центрифугат 0.5 мл дистиллированной воды. Оптическую плотность измеряют при 440 нм, ширина кюветы 5 мм.
Расчет. По калибровочной кривой находят массовое содержание [%] пировиноградной кислоты и производят расчет процентного содержания ПВК по формуле
W = C ×100 , 0.1×1000
где 0.1 – количество крови в пробе, мл.
Практическая значимость работы. Определение содержания пировиноградной кислоты в крови имеет клинико-диагностическое значение. При гипоавитаминозе В1, заболеваниях печени, сердечной декомпенсации, уремиях, а
также при инфекционных заболеваниях содержание пировиноградной кислоты в крови и других тканях возрастает, увеличивается также ее выделение с мочой.
Лабораторная работа 7
ТИТРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЕЧНЫХ ПРОДУКТОВ ОБМЕНА ПУРИНОВ МОЧЕВОЙ КИСЛОТЫ
Цель работы. Освоение количественного метода определения конечного продукта обмена пуриновых оснований мочевой кислоты в моче.
Принцип метода. Метод основан на способности мочевой кислоты восстанавливать фосфорно-молибденовый реактив Фолина с образованием продуктов, окрашенных в синий цвет. При титровании красной кровяной солью это соединение окисляется и синее окрашивание исчезает.
Ходы работы. Берут две колбы емкостью 50 мл и помешают в одну из них 2 мл мочи (опытная проба), в другую – 2 мл раствора мочевой кислоты,
24
содержащей 0.25 г/л мочевой кислоты (стандартная проба). В обе колбы вносят по 1 мл 20 %-го раствора едкого натрия и 1 мл раствора фосфорномолибденового реактива. В колбах развивается синее окрашивание. Обе пробы (опытную и стандартную) титруют 0.01 н раствором красной кровяной соли K3[Fe(CN)6] до исчезновения синего окрашивания.
Ход работы и результаты титрования заносятся в таблицу.
Определение содержания мочевой кислоты в моче
|
|
Стан- |
Реактивы, мл |
Расход |
Мочевая |
|
|
|
|
|
Иссле- |
дартный |
|
|
|
||||
|
|
|
на |
кислота |
|
|
Вы- |
||
|
дуемая |
раствор |
|
|
|
|
|||
Проба |
NaOH |
Реактив |
титро- |
K [Fe(CN) |
] |
||||
|
жидкость, |
мочевой |
вание |
3 |
6 |
|
воды |
||
|
(моча), мл |
кислоты, |
20 % |
Фолина |
в суточной |
|
|||
|
0.01 н |
моче, г/сут |
|
||||||
|
|
мл |
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Опытная |
2.0 |
– |
1 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Стандартная |
– |
2.0 |
1 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Содержание мочевой кислоты в суточном количестве мочи рассчитывают по следующей формуле:
m = (Cоп × 0.25а)
Cст ,
где Cоп – количество 0.01 н раствора K3[Fe(CN)6], использованного для титро-
вания опытной пробы, мл; Cст – количество 0.01 н раствора K3[Fe(CN)6], ис-
пользованного для титрования стандартной пробы, мл; 0.25 – количество мочевой кислоты в 1 л стандартной пробы, г. Суточное количество мочи около 1.5 л.
Практическая значимость работы. Определение концентрации мочевой кислоты имеет значение для диагностики поражений почек и подагры. Увеличение количество мочевых кислот в моче и крови наблюдается при патологических состояниях, связанных с усиленным распадом нуклеопротеинов при лейкозах, лейкемии, лучевой болезни, злокачественных анемиях, после приема мочегонных, пиразикамидов и салициловой кислоты.
Лабораторная работа 8
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БИОСУБСТРАТА (ВОЛОСЫ ИЛИ НОГТИ)
Цель работы: физико-химический анализ биосубстрата (волосы или ногти) методом рентгеновской флуоресцентной спектроскопии.
25
В последние годы анализ биологических объектов стал одной из основных областей применения инструментальных методов анализа, так как такие исследования актуальны при диагностике врожденных патологий, профессиональных заболеваний, связанных со спецификой промышленного производства, экологически обусловленных заболеваний и т. д.
Недостаток жизненно важных элементов в питьевой воде, промышленное загрязнение окружающей среды токсичными и радиоактивными элементами, неполноценное питание, болезни, некоторые лекарственные средства могут приводить к возникновению заболеваний, в основе которых лежит дефицит, избыток или дисбаланс микроэлементов в организме. Для оценки уровня содержания микроэлементов в организме человека наряду с такими диагностическими биосубстратами, как кровь, моча, ногти, хорошей информативностью обладают волосы. Для волос характерна фиксированная динамика роста (0.35…0.4 мм/сут.), в связи с чем наиболее адекватной для оценки микроэлементного статуса организма, на момент обследования, является прикорневая часть волос. Элементы, которые с кровью попадают в клетки волос, в минеральный обмен организма включаются с существенным затруднением.
В волосах происходит концентрирование микроэлементов, в отличие от крови, которая, в основном, выполняет в организме транспортную функцию. Волосы наиболее полно отражают уровень содержания как токсичных (свинец, кадмий, мышьяк и т. д.), так и жизненно необходимых элементов (цинк, селен, железо и т. д.). Микроэлементный состав крови первым реагирует на повышение уровня содержания тяжелых металлов, но может не отражать истинный уровень их содержания в организме. Поэтому важно исследование таких биосубстратов, которые наиболее полно отражают элементный ста-
тус1 во всем организме. В этом отношении наиболее информативны волосы.
Исследование микроэлементов в волосах дает возможность выявить наличие патологических процессов на предклинической стадии, что позволяет внести соответствующую корректировку в профилактику заболевания. Все это имеет большое значение для предупреждения многочисленных заболеваний. Особую пользу анализ волос может принести при изучении влияния на организм человека некоторых микроэлементов и отдельных тяжелых металлов. Данные анализа волос показывают, что отравления тяжелыми металлами
1 Элементный статус – достоверное отражение происходящих в организме человека биохимических процессов.
26
в настоящее время встречаются все чаще. Химический анализ волос, взятых у людей, живущих сегодня, и у людей, умерших несколько столетий назад, показывает, что содержание металлов в волосах выросло в 1000 раз, что конечно, связано с резким ухудшением экологической среды.
Биологическая роль некоторых химических элементов
Для нормального протекания физиологических процессов в организме должен поддерживаться определенный баланс концентраций макро- и микроэлементов в тканях и биологических жидкостях организма. Вместе с тем, вследствие неблагоприятного соотношения элементов в окружающей среде такой баланс может нарушаться. Рассмотрим роль ряда элементов в жизнедеятельности организма.
Медь относится к эссенциальным микроэлементам, т. е. элементам, ко-
торые играют особо важную роль в процессах жизнедеятельности организма, находясь в очень малых концентрациях (тысячные доли процента и ниже). Вместе с тем, при хронической интоксикации медь вызывает нарушения функции нервной системы, почек, печени, желтуха и гемолитический шок. Отравление может произойти, например, вследствие действия фунгицидов или поглощения медьсодержащих растворов. Симптомы отравления солями меди характеризуются тошнотой, рвотой, головными болями, поносом, болями в животе.
Медь – каталитический компонент ряда ферментов и структурный компонент многих важных белков. Большинство из многочисленных медьсодержащих белков является оксидазами, они локализуются вне цитоплазмы – на поверхности клеточных мембран или в везикулах. Медьсодержащий металлофермент – супероксиддисмутаза – обеспечивает защиту компонентов плазмы и цитоплазмы от свободных радикалов. Фермент цитохром-c-оксидаза важен во внутриклеточных энергетических процессах. Лизилоксидаза необходима для стабилизации внеклеточного матрикса, в том числе для образования кросс-связей коллагена и эластина. Медьсодержащие ферменты, в том числе, церулоплазмин, участвуют в метаболизме железа. К медьсодержащим относится фермент, катализирующий превращение допамина в норадреналин, и фермент, катализирующий синтез мелатонина. Медьсодержащие белки участвуют в процессах транскрипции генов.
Врожденные дефекты метаболизма меди вызывают тяжелые нарушения: синдром Менкеса (генетически обусловленное нарушение всасывания меди в
27
кишечнике), болезнь Вильсона– Коновалова (нарушение транспорта меди, ее включения в церулоплазмин, сопровождающееся накоплением меди в органах и тканях). Симптомы дефицита меди включают нейтропению, анемию (не чувствительную к препаратам железа), остеопороз, различные поражения костей и суставов, сниженную пигментацию кожи, неврологические симптомы и нарушения работы сердца. Дефицит всасывания меди может наблюдаться при диффузных заболеваниях тонкого кишечника и на фоне высокого содержания конкурирующих с медью ионов цинка и кадмия. Дефицит меди может наблюдаться у грудных детей (особенно недоношенных) на медьдефицитном молочном питании, у пациентов на длительном парентеральном питании с дефицитом микроэлементов, у пациентов, получающих препараты цинкатипа пеницилламин.
Цинк также относится к эссенциальным микроэлементам. Цинк входит в состав более 300 металлоферментов, среди которых – карбангидраза, щелочная фосфатаза, РНК- и ДНК-полимеразы, тимидинкиназные карбоксипептидазы, алкогольдегидрогеназа. Ключевая роль цинка в синтезе белка и нуклеиновых кислот объясняет нарушения роста и заживления ран, наблюдающиеся при дефиците этого элемента. Он участвует в механизмах регуляции экспрессии генов. Это связано в целом с биологией развития, в том числе, развития плода, а также с регуляцией синтеза стероидных, тиреоидных и других гормонов.
Клинические проявления дефицита цинка (как это и следует из многообразия его биологических функций) не специфичны и зависят от степени и длительности дефицита. Симптомы дефицита включают задержку роста, учащение инфекций, связанное с нарушениями функций иммунной системы, диарею, потерю аппетита, изменение познавательных функций, нарушения углеводного обмена, анемию, увеличение печени и селезенки, тератогенез, поражения кожи, выпадение волос и нарушение зрения.
Высокий уровень цинка в организме человека в первую очередь отражается на уменьшении активности ряда ферментативных систем, например угнетение активности железосодержащих ферментов (антагонизм Zn и Fe). Редкие случаи избыточного поступления цинка в организм связывают с использованием гальванизированных емкостей для питьевых жидкостей. Избыток цинка может вызывать раздражение желудочно-кишечного тракта.
Для исследования статуса цинка в организме предпочтительна сыворотка или плазма (гемолиз может искажать результат). Уровень цинка в крови под-
28
вержен суточному ритму – пик утром около 9 часов утра и затем еще один около 6 часов вечера. После еды уровень цинка снижается. Следует контролировать условия взятия пробы (время суток, прием пищи, наличие лекарственной терапии).
Исследование уровня цинка в волосах используют для оценки дефицита этого элемента. Низкий уровень цинка в волосах детей коррелирует с замедлением общего роста. Следует иметь в виду, что на результат исследования могут влиять скорость роста волос и внешние загрязнения: краски для волос, лечебные шампуни, косметические средства для волос, которые содержат цинк.
Свинец – его токсичность известна человечеству очень давно. Использование свинца для изготовления посуды и водопроводных труб приводило к массовому отравлению людей. В настоящее время свинец продолжает быть одним из основных загрязнителей окружающей среды, так как выброс соединений свинца в атмосферу составляет свыше 400 000 т ежегодно. Свинец накапливается в основном в скелете в форме малорастворимого фосфата Pb3(PO4)2, а при деминерализации костей оказывает непрерывное токсическое действие на организм. Поэтому свинец относятся к кумулятивным ядам. Токсичность соединений свинца связана, прежде всего, с его комплексообразующими свойствами и большим сродством к биолигандам, особенно содержащим сульфгидрильные группы (–SH):
2R–SH + Pb 2+ → RS–Pb–SR + 2H +
Образование комплексных соединений ионов свинца с белками, фосфолипидами и нуклеотидами приводит к их денатурации. Часто ионы свинца ингибируют металлоферменты EM2+, замещая в них жизненно важные элементы:
Pb2+ + EM2+ → EPb2+ + M2+
Свинец и его соединения относятся к ядам, действующим преимущественно на нервную систему, кровеносные сосуды и кровь. При этом соединения свинца влияют на синтез белка, энергетический баланс клеток и их генетический аппарат.
Мышьяк – один из наиболее хорошо известных токсичных металлов. Он существует в виде ряда токсичных и нетоксичных форм. Токсичными являются неорганические соединения As3+ – As (III) и As5+ – As (V). При этом соединения As (V) более токсичены. Нетоксичные формы органического мышьяка присутствуют в различных видах пищи; наиболее часто – в морепродуктах. В низких концентрациях мышьяк, предположительно, можно от-
29
нести к условно необходимым элементам. Он взаимодействует с тиоловыми группами белков, цистеином, глутатионом, липоевой кислотой и влияет на окислительные процессы в митохондриях.
Дефицит мышьяка, как было показано в экспериментальных исследованиях на животных, приводит к нарушению фертильности, выкидышам, мертворождению, снижению противоопухолевого иммунитета. При дефиците мышьяка в органах и тканях повышается концентрация меди и марганца.
Соединения мышьяка используют в медицинских целях. Неорганические соединения мышьяка в небольших количествах могут присутствовать в составе общеукрепляющих, тонизирующих средств, в лечебных минеральных водах и грязях. Органические соединения мышьяка используют как антимикробные и противопротозойные препараты.
Интоксикация мышьяком может возникнуть вследствие попадания в организм пестицидов. Другие антропогенные источники мышьяка связаны с промышленной деятельностью человека. Следует отметить, что производство и использование полупроводников на основе арсенида галлия и других элементов также может быть одной из причин попадания мышьяка в организм.
При тяжелых отравлениях мышьяком на первый план выступают желу- дочно-кишечные симптомы, возможны судороги и кома, нарушения дыхания и сердечного ритма. Хроническое воздействие вызывает поражение кожи и слизистых, изменения со стороны нервной системы (невралгические боли в ногах, слабость, расстройства чувствительности), нарушения со стороны пищеварительного тракта. Описаны случаи рака, вызванного мышьяком.
При поступлении в организм токсичных форм As (V) и As (III) они частично выводятся с мочой в неизмененной форме, метаболизируя в некоторой степени в менее токсичные метилированные метаболиты (монометиларсин, диметиларсин), а частично проникают и накапливаются в клетках и тканях, взаимодействуя с фосфатами. Токсичность неорганического мышьяка обусловлена конкуренцией с фосфатами и ингибированием ферментов, участвующих в энергетических процессах, а также связыванием с сульфгидрильными группами белков. Поэтому мышьяк называют «тиоловым ядом».
При поступлении в организм мышьяка, повышение его концентрации в крови наблюдается лишь в течение 4 ч. Исследование крови на присутствие мышьяка используется только для установления факта острого отравления. В качестве материала для исследования может быть выбрана моча, поскольку мышьяк выделяется из организма преимущественно почками и находится в моче
30