LS-Sb88916

3. Методом добавок – измеряют Ax , добавляют в раствор х известное количество определяемого компонента а и измеряют Ax + а . При условии подчинения поглощения закону БЛБ Cx рассчитывают по следующим урав-

нениям:

где Ax и Ax + а – оптические плотности поглощения исследуемого раствора и этого же раствора с добавкой; Ca и Va – концентрация и объем стандартного раствора (добавки); Cx и Vx – концентрация и объем исследуемого раствора;

Cx + а и (Vx +Va ) – концентрация и объем раствора с добавкой и учетом раз-

бавления.

Для уменьшения неточности расчета значение Ax + а – Ax должно быть

не менее 0,1. Метод добавок не требует приготовления стандартных растворов на различных фонах, так как вещество вносится непосредственно в исследуемый раствор, что позволяет компенсировать влияние физических и инструментальных помех.

Лабораторная работа 1

КАЧЕСТВЕННОЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА С

Особенности строения молекулы аскорбиновой кислоты (витамин С) заключаются в наличии γ-лактонного кольца, содержащего ендиольный фрагмент, в котором два углеродных атома имеют степень окисления +1. Благодаря этим особенностям аскорбиновая кислота – довольно сильная

кислота ( pKaI = 4.2 ) и сильный восстановитель. При ее окислении образуется

дегидроаскорбиновая кислота, которая в мягких условиях легко восстанавливается опять в аскорбиновую кислоту:

11

В организме в водной среде сопряженная восстановительно-окисли- тельная пара – аскорбиновая и дегидроаскорбиновая кислоты – является активным антидотом свободнорадикальных окислительно-восстановительных процессов, протекание которых усиливается при различных патологических состояниях организма. Так называемое свободнорадикальное окисление-вос- становление при низкой интенсивности метаболически нормально. Свободные радикалы участвуют в процессах клеточного деления, обновления ядерных мембран и многих других важных процессах. Но это необходимо и полезно до тех пор, пока интенсивность образования радикалов и их концентрация в клетке не превышают определенной нормы.

Главным источником радикалов в организме служит молекулярный кислород, а в случае радиационного воздействия – вода. Скорость свободнорадикального окисления определяется концентрацией радикалов и практически не регулируется организмом.

При экстремальных и патогенных воздействиях на организм образование кислородных радикалов в клетках и тканях резко усиливается, так как интенсифицируются окислительное фосфорилирование и гидроксилирование ксенобиотиков. Происходящее при этом с участием различных цитохромов окисление может способствовать появлению в организме активных форм кислорода и тем самым – свободнорадикальному окислению. Усиление свободнорадикального окисления вызывается разнообразными физическими факторами: радиоактивным, ультрафиолетовым и лазерным излучениями, шумом, вибрацией, а также различными болезнями: простудными легочными заболеваниями, атеросклерозом, инфарктом миокарда, инсультом мозга, остеохондрозом, диабетом, язвой желудка, туберкулезом, злокачественными образованиями. Возможно, что свободнорадикальное окисление в перечисленных случаях является не только следствием этих болезней, но и одной из причин их возникновения.

12

В организме свободнорадикальное окисление сдерживается многокомпонентной антиоксидантной буферной системой, которая, превращая радикалы в малоактивные соединения, прерывает цепные реакции. Эти функции осуществляют:

–антиоксидантные и антиперекисные ферменты: супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза;

–антиоксиданты1 – органические соединения с выраженными восстановительными свойствами: различные тиолы (глутатион, цистеин, дегидролипоат), аскорбиновая кислота, β-каротин, а также витамины Е (токоферол), К, Р и стероидные гормоны.

Все антиоксиданты, взаимодействуя с активными формами кислорода, прерывают свободнорадикальное окисление и переходят в окисленные формы, которые под действием соответствующих ферментов опять превращаются в восстановленные формы.

Эффективным антиокидантным средством и является аскорбиновая кислота (витамин С), которая под действием окислителей, особенно радикалов, легко отдает два электрона и два катиона водорода, переходя при этом, как уже отмечалось, в дегидроаскорбиновую кислоту.

Вероятно, именно за счет антиоксидантной активности прием витамина С в повышенных дозах способствует предотвращению простудных и других заболеваний или снижению остроты их протекания.

Определение содержания витаминов в крови, моче, тканях имеет диагностическое значение. Массовое содержание витамина С в сыворотке крови

составляет 10−3 %, в моче – (2...5) ×10−3 %.

Качественное определение витамина С

Реакция на аскорбиновую кислоту основана на ее способности восстанавливать такие вещества, как железосинеродистый калий, метиленовая синь, молекулярный йод, 2.6-дихлорфенолиндофенол и др.

Восстановление железосинеродистого калия. Реакция основана на восстановлении железосинеродистого калия (K3Fe(СN)6) аскорбиновой кис-

лотой в железистосинеродистый калий (K4Fe(СN)6), который в соединении с хлорным железом образует берлинскую лазурь:

1 Антиоксиданты – вещества, обратимо реагирующие со свободными радикалами и окислителями и предохраняющие от их воздействия жизненно важные метаболиты.

13

+2K3[Fe(CN)6]+2KOH

HO OH

HO

O

O

OH+2K4[Fe(CN)6]+2H2O;

OO

2)3K4[Fe(CN)6]+4FeCl3Fe4[Fe(CN)6]3+12KCl

Берлинская

лазурь Ход работы. В двух пробирках смешивают по одной капле 5 %-го рас-

твора железосинеродистого калия и 1 %-го раствора хлорного железа. В одну из пробирок добавляют 5–10 капель раствора аскорбиновой кислоты, в другую – дистиллированную воду. В первой пробирке жидкость из зеленовато-бурой становится зеленовато-синей и выпадает синий осадок берлинской лазури.

Восстановление метиленового синего. Химизм реакции:

Метиленовый синий

Лейкоформа метиленового синего

14

Ход работы. В пробирке смешивают 2–3 капли раствора аскорбиновой кислоты и по капле растворов соды и метиленового синего.

Реактивы: железосинеродистый калий, 5 %-й раствор; хлорное железо, 1 %-й раствор; раствор аскорбиновой кислоты; метиленовый синий, 0.01 %-й раствор; углекислый натрий, 10 %-й раствор.

Количественное определение витамина С колориметрическим методом

Цель работы. Освоение колориметрического метода количественного определения витамина С в биологических жидкостях.

Принцип метода. Аскорбиновая кислота восстанавливает фосфор- но-молибденовую кислоту в молибденовую синь. Интенсивность синего окрашивания пропорциональна концентрации аскорбиновой кислоты.

Исследуемый материал: раствор аскорбиновой кислоты.

Реактивы: фосфорно-молибденовая кислота, 1 %-й раствор; серная кислота, 16 %-й раствор.

Оборудование: фотоэлектроколориметр, пробирки, пипетки на 1 и 10 мл. Ход работы. К 0.5 мл исследуемого раствора прибавляют 0.5 мл дистиллированной воды, 1 мл 1 %-го раствора фосфорно-молибденовой кислоты

и 3 мл 16 %-го раствора серной кислоты.

Для контрольной пробы берут 2 мл дистиллированной воды, 2 мл 1 %-го раствора фосфорно-молибденовой кислоты и 6 мл 16 %-го раствора серной кислоты.

Содержимое пробирок перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. По истечении указанного времени измеряют величину экстинкции испытуемой смеси на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром, используя кюветы с толщиной слоя 10 мм.

Расчет. По величине экстинкции с помощью калибровочной кривой определяется содержание витамина С в микрограмме в 0.5 мл испытуемой пробы (0.5 мл контрольной задачи) – обозначим эту величину буквой А:

где 0.5×10−3 – количество, мг; умножаем на 1000 для перевода из микрограммов в миллиграммы; 100 – коэффициент для вычисления в процентах.

15

Количественное определение витамина С по методу Тильманса

Цель работы. Освоение титриметрического метода (Тильманса) количественного определения витамина С в биологических жидкостях.

Принцип метода. Витамин С (аскорбиновая кислота) восстанавливает 2.6-дихлорфенолиндофенол. Этот индикатор в окисленной форме имеет синюю окраску в щелочной среде, розовую – в кислой. Как только вся имеющаяся в растворе аскорбиновая кислота будет окислена, первая синяя капля краски Тильманса (2.6-дихлорфенолиндофенол) окрасит раствор в розовый цвет (кислая среда). Аскорбиновая кислота при этом переходит в дегидроформу:

Окраска 2.6-дихлорфенолиндофенола в зависимости от реакции среды:

–окисленная форма, щелочная среда: Синий цвет

–окисленная форма, кислая среда: Красный цвет

–восстановленная форма: Бесцветный

Исследуемый материал: раствор аскорбиновой кислоты.

Реактивы: 2.6-дихлорфенолиндофенол, 0.001 н раствор; соляная кислота, 5 %-й раствор.

Оборудование: колбы на 50…100 мл, пипетки на 5 мл, бюретки.

Ход работы. Для определения содержания витамина С в моче или растворе препарата или аскорбиновой кислоты берут 5 мл исследуемого раствора

16

или мочи, прибавляют 5 мл 5 %-й соляной кислоты и титруют краской Тильманса до розового окрашивания. Титрование повторяют 2–3 раза. На основании средней величины титрования вычисляют количество витамина С.

Расчет:

Аскорбиновая кислота = A ×10010−3, 11.4 ×5

где А – количество раствора 2.6-дихлорфенолиндофенола, использованного для титрования; 11.4 – количество 0.001 н раствора 2.6-дихлорфенолиндофенола,

восстанавливаемого 1 мг аскорбиновой кислоты, мл; 5×10−3 – масса исследуемого материала, мг; 100 – коэффициент для вычисления в процентах.

Для расчета содержания витамина С в суточной моче величину, полученную после вычисления по приведенной выше формуле, умножаем на 1500 мл – среднесуточное количество мочи.

Лабораторная работа 2

КАЧЕСТВЕННОЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА

Цель работы. 1. Ознакомление со специфическими цветными реакциями на холестерин.

2. Освоение метода количественного определения холестерина, осно-

ванного на реакции Либермана– Бухардта.

Исследуемый материал: хлороформенный холестеринсодержащий экс-

тракт, спиртовые растворы холестерина.

Реактивы: серная кислота, концентрированная; уксусный ангидрид; ук-

сусная кислота, концентрированная; реактив Либермана– Бухардта.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; термостат, установленный на

37 ° С; пробирки; пипетки на 0.1, 1 и 5 мл.

Качественные цветные реакции на холестерин

Эти реакции сходны друг с другом по природе химических превращений.

Под влиянием концентрированной H2SO4 и уксусного ангидрида холестерин превращается в углеводороды С54Н86 и С54Н88 (бихолестадиены), которые с кислотой образуют диеновые кислоты: с двумя молекулами H2SO4 – продукт

17

красного цвета, с одной молекулой H2SO4 – продукт зеленого цвета (реакция Либермана– Бухардта).

Реакция Шиффа. В пробирку наливают 1 мл хлороформенного раствора холестерина и осторожно по стенке пробирки подслаивают около 1 мл кон-

центрированной серной кислоты. На границе двух жидкостей появляется кольцо красного цвета.

Реакция Сальковского. После проведения пробы Шиффа жидкость осторожно встряхивают, перемешивая содержимое пробирки. После отслаи-

вания верхний хлороформенный слой жидкости окрашивается в красный цвет,

нижний имеет желто-оранжевую окраску с зеленой флуоресценцией.

Реакция Либермана– Бухардта. Около 1 мл хлороформенного раствора холестерина налить в пробирку, прибавить 10 капель уксусного ангидрида и

2 капли концентрированной серной кислоты, хорошо перемешать. Если кон-

центрация холестерина более 1 %, наблюдается зеленое окрашивание. Эта реакция положена в основу количественного определения холестерина по методу Илька.

Количественное определение холестерина колориметрическим методом Илька

Принцип метода. В основе колориметрического определения холесте-

рина лежит цветная реакция Либермана– Бухардта. Основанный на данной реакции метод Илька утвержден в качестве основного унифицированного метода определения общего холестерина сыворотки крови в клини-

ко-диагностических лабораториях.

Ход работы. К 2.1 мл реактива Либермана– Бухардта, содержащего ук-

сусную кислоту, уксусный ангидрид и серную кислоту в соотношении 1 : 5 : 1 (по объему), добавляют 0.1 мл испытуемого образца. Если исследуется сы-

воротка крови, ее добавляют медленно, так, чтобы она стекала по стенке пробирки. Все пробирки и пипетки должны быть сухими, иначе возможно помутнение раствора. Пробирки энергично встряхивают и помещают в тер-

мостат при 37 ° С на 20 мин. Величину экстинкции измеряют на фотоэлектро-

колориметре при длине волны 670 нм в кювете толщиной 5 мм, для контроля используют реактив Либермана– Бухардта.

Расчет количества холестерина в пробе С производят по формуле

18

С = с·1000,

где с – количество холестерина, определенное по калибровочной кривой, мг; 1000 – коэффициент пересчета результатов в массовую долю.

Практическая значимость работы. 1. Освоенный метод определения холестерина используется как для определения липидного состава биомембран, так и для определения холестерина в крови и хлороформенных экстрактах различных тканей.

2. Концентрация холестерина в крови является важным диагностическим тестом, так как длительная гиперхолестеринемия приводит к развитию атеросклероза.

Лабораторная работа 3

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРА В КРОВИ

Цель работы. Освоение колориметрического метода определения сахара в крови и других биологических жидкостях.

Принцип метода. Колориметрический метод определения глюкозы основан на качественной реакции обнаружения глюкозы орто-толуидином.

Исследуемый материал: кровь кролика или раствор глюкозы. Реактивы: трихлоруксусная кислота, 3 %-й раствор; орто-толуидиновый

реактив; стандартный раствор глюкозы, 5.6 ммоль/л.

Оборудование: пробирки, пипетки на 1…2 мл, микропипетки на 0.1 мл, фотоэлектроколориметр, водяная кипящая баня.

Ход работы. Взять 0.1 мл крови кролика с целью определения сахара в крови. Глюкоза при нагревании с орто-толуидином в растворе уксусной кислоты дает зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации глюкозы:

D-глюкоза орто-толуидин Продукт конденсации зеленого цвета

Готовится опытная проба. Для это в пробирку наливают 0.9 мл 3 %-го раствора трихлоруксусной кислоты и добавляют в нее 0.1 (мл крови. Цен-

19

трифугируют в течение 40 мин при 3000 об./мин. Надосадочную жидкость

(центрифугат) сливают в чистую пробирку. Далее 0.5 мл центрифугата по-

мещают в пробирку, добавляют 2 мл орто-толуидинового реактива, закры-

вают стеклянной пробкой и помещают в кипящую водяную баню на 8 мин. В

результате нагревания содержимое пробирки окрашивается в зеленый цвет.

Его охлаждают под струей холодной воды, колориметрируют на фотоэлек-

троколориметре (с оранжевым или красным светофильтром) в кювете тол-

щиной 5 мм и сравнивают результат с результатом колориметрирования воды.

Готовится стандартная проба. Ее готовят так же, как и опытную, но вместо крови добавляют 0.1 мл стандартного раствора глюкозы (5.6 ммоль/л),

перемешивают, отмеривают 0.5 мл этого раствора в новую пробирку, добав-

ляют 2 мл opтo-толуидинового реактива, кипятят 8 мин на водяной бане,

охлаждают и колориметрируют.

Расчет:

Cсах = Cст Еоп ,

Ест

где Cст – концентрация глюкозы в стандартном растворе (5.6 ммоль/л);

Еоп – экстинкция опытной пробы; Ест – экстинкция стандартного раствора.

Практическая значимость работы. Предложенный метод позволяет просто и быстро определить концентрацию сахара в биологических жидкостях. Норма содержания глюкозы в крови человека (натощак) 3.5...6.1 ммоль/л. Повышенное или заниженное содержание указывает на различные заболевания.

Лабораторная работа 4

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УГЛЕВОДОВ (ПОЛЯРИМЕТРИЯ)

Цель работы. Освоение унифицированного экспресс-метода определения количества сахара в растворах и биологических жидкостях.

Принцип метода. Метод основан на способности веществ, содержащих хотя бы один асимметричный атом углевода, отклонять плоскость поляризации при прохождении через него прямолинейного поляризованного света. Измерения проводят на поляриметре, позволяющем определить величину отклонения плоскости поляризации от начального положения, выраженную в угловых градусах. Величина угла вращения зависит от природы оптически

20