Структурная основа разницы в сродстве связывания с кор-ферментом между субъединицами σ

Семейство белков σ⁷⁰ имеет общую структурную организацию, за исключением σ⁵⁴, которая состоит из четырех консервативных доменов (4,5). Роль каждого домена в распознавании промотора была тщательно изучена с использованием генетического, химического и физического подходов (обзор см. 4). Однако, наши знания о роли σ-структурных доменов (последовательностях) в межбелковых взаимодействиях с кор-ферментом ограничены. Мы идентифицировали поверхности взаимодействия субъединиц σ⁷⁰, σ^N и σ^S на субъединицах кор-фермента после взаимодействия контактно-зависимых мест расщепления с тетраацетатом железа (S) -1- (п-бромацетамидобензил)этилендиамин (Fe-BABE) (42), связанным в различных позициях с σ-субъединицами (43–45). Результаты показали, что несколько мест вдоль этих σ-полипептидов вовлечены в контакт с β- и β’-субъединицами кор-фермента, большинство из которых расположены в консервативных местах (последовательностях) среди трех σ-субъединиц. Исследования на мутацию также показали, что субъединица σ⁷⁰ содержит множественные поверхности взаимодействия с кор-ферментом (46) и, кроме того, одни и те же области и даже эквивалентные аминокислотные остатки, как в σ⁷⁰, так и σ^H, участвуют в связывании кор-фермента. Если основные поверхности для межбелковых контактов с кор-ферментом одни и те же в семействе белков, то различия в сродстве связывания кор-фермента, наблюдаемые в этом исследовании, могут объясняться различиями в количестве поверхностей контакта или остатков контактной аминокислоты или в сродстве второстепенных поверхностей, характерных для каждой субъединицы. Эксперименты по контакт-зависимому расщеплению белка с FeBABE действительно указали на присутствие небольшого количества уникальных мест контактов субъединиц с кор-ферментом, характерных для каждой субъединицы (43–45).

Внутриклеточные уровни различных холоферментных форм рнк-полимеразы e.Coli

Внутриклеточная концентрация в E.coli W3110 (A) является самой высокой для субъединицы σ⁷⁰ среди семи σ-субъединиц E.coli как в экспоненциальной, так и в стационарной фазах, а также в различных стрессовых условиях (20–22). Исходя из констант диссоциации связывания кор-фермента с внутриклеточными концентрациями, мы можем теперь оценить внутриклеточную концентрацию каждого холофермента (см. Таблицу 1). Концентрация РНК-полимеразы в E.coli W3350 составляет приблизительно 2000 молекул на клетку в экспоненциальной фазе, из которых около трети (700 молекул) остается в цитозоле (3,6). Поскольку общее количество объединенных σ-субъединиц (∼1200 молекул на клетку) больше, чем у РНК-полимеразы, не участвующей в цикле транскрипции (∼700 молекул на клетку), то большая часть РНК-полимеразы в цитозоле должна быть в форме холофермента, связанной с одной из σ-субъединиц. Например, в клетке E.coli W3110, находящейся в экспоненциальной фазе, число каждого холофермента составляет 545 молекул для Eσ⁷⁰, 100 молекул для Eσ^F и 55 молекул для Eσ^N.

Однако считается, что некоторые из субъединиц σ⁷⁰, σ^F и σ^N существуют как комплексы с анти-σ факторами (24,36). Таким образом, фактические концентрации холоферментов Eσ⁷⁰, Eσ^F и Eσ^E в E.coli должны быть ниже уровней, оцененных выше. Например, значительная часть субъединицы σ^F остается в виде комплекса с FlgM (анти-σ^F фактором) в тех же условиях культивирования, что и используемые в этом исследовании (36,37). Активность σ^E регулируется с помощью RseA (регулятор σE или анти-σ^E фактор), который связан с внутренней мембраной и подавляет активность σ^E путем непосредственного взаимодействия с σ^E (38,39). Недавно мы идентифицировали Rsd (регулятор для σ^D), предполагаемую анти-σ⁷⁰-субъединицу, которая вырабатывается в E.coli при переходе от экспоненциальной к стационарной фазе (25,36). Контроль функциональных форм σ-субъединиц с помощью анти-σ-факторов или σ-переключающих факторов может в определенной степени способствовать регулированию относительных уровней различных форм холофермента (6, 27, 47).