Competition among seven Escherichia coli
σ subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase
Определения
●РНК-полимераза — фермент, осуществляющий синтез молекул РНК. В узком смысле, РНК-полимеразой обычно называют ДНК-зависимые РНК-полимеразы, осуществляющие синтез молекул РНК на матрице ДНК, то есть осуществляющие транскрипцию.
●Кор-фермент. В свободном состоянии кор-фермент не является полноценной РНК-полимеразой, при объединении с σ-субъединицей образуется холофермент;
●σ-субъединица обеспечивает специфичность связывания холофермента с определенными участками ДНК;
●Холофермент - фермент, состоящий из неактивной белковой части — апофермента и активирующей ее небелковой группы — кофактора.
2
Строение кор- фермента
У бактерий все стадии инициации осуществляются
холоферментом РНКП, состоящим из кор-фермента и фактора инициации - σ -субъединицы , которая диссоциирует при переходе к элонгации транскрипции
3
4
Анализ работы:
Цель |
|
Методы: |
Результаты: |
работы: |
|
|
|
|
|
|
|
Проверить |
модели |
Все семь субъединиц E.coli σ |
σ70 является самой активной |
конкуренции σ в |
глобальной |
были очищены и сравнены на |
субъединицей с точки зрения |
регуляции транскрипции генов |
предмет их связывающего |
связывания с кор-ферментом, |
|
E.coli |
|
сродства с одной и той же |
за которым следуют σN, σF, σE/ |
|
σFecI, σH и σS в порядке |
||
|
|
РНК-полимеразой |
убывания |
|
|
|
|
5
Функции σ-субъединиц
σS |
|
σN |
|
σH |
|
σF |
|
σE |
|
σFecI |
|
|
необходим |
для |
транскрибирует |
|
|
|
|
транскрипцию |
участвует |
в |
|||
гены, |
которые |
|
|
|
|
|||||||
транскрипции |
|
|
|
необходим |
для |
генов |
для |
транскрипционной |
||||
|
регулируются |
транскрибирует |
||||||||||
некоторых генов, |
экспрессии |
генов |
экстрацитоплазмат |
регуляции |
генов |
|||||||
доступностью |
гены |
белков |
||||||||||
специфичных |
для |
жгутиков |
и |
ических |
функций, |
для |
|
|||||
азота и |
некоторых |
теплового шока |
|
|||||||||
стационарной |
|
хемотаксиса |
|
а также за реакцию |
экстрацитоплазмат |
|||||||
|
генов |
ответа на |
|
|
|
|||||||
фазы |
|
|
|
|
|
теплового шока |
ических функций |
|||||
|
стресс |
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
6
использова
ли
Плазмиды: |
Штамм |
Среда |
|
|
|
pGEMD, |
Escherichia coli |
Luria-Bertani |
pKES259, |
BL21 (DE3) |
(LB), |
pETF, pETSF, |
|
содержащей |
pET21H, |
|
ампициллин |
pRPOE и |
|
(0,2 мг/мл) |
pETFecI |
|
|
|
|
|
Что делали
1.Провели индукцию с IPTG;
2.Промыли 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA и 150 мМ NaCl, pH 8,0;
3.Хранить при -80;
4.Ресуспендировали в буфере для лизиса, обработать лизоцимом;
5.Гомогенизировали путем мягкой обработки ультразвуком;
6.Извлекали ультрацентрифугированием;
7.Все семь σ-белков были извлечены из телец включения с помощью элюирующего буфера;
7
Результаты
8
Константа диссоциации образования холофермента Eσ70
Эту магию мы не поняли
Определение сродства между субъединицей σ-70 и кор-ферментом |
|
А) насыщение кор-фермента |
|
B) насыщение σ-70. |
9 |
|
Соперничество между семью субъединицами за кор- фермент
10