Конкуренция среди семи субъединиц Escherichia coli σ: относительное сродство к основной РНК-полимеразе

Краткое содержание

В кишечной палочке Escherichia coli существует семь различных видов σ РНК-полимеразы, каждый из которых связывается с одним видом кор-фермента и тем самым направляет транскрипцию определенного набора генов. Чтобы проверить модели конкуренции σ в глобальной регуляции транскрипции генов все семь субъединиц E.coli σ были очищены и сравнены на предмет их связывающего сродства с одной и той же РНК-полимеразой. При наличии фиксированного количества σ⁷⁰, основного σ для генов, связанных с ростом, уровень образования холофермента σ⁷⁰ увеличивался линейно с увеличением уровня кор-фермента, давая кажущийся К_d для кор-фермента 0,26 нМ. Эксперименты по смешанному восстановлению в присутствии фиксированного количества кор-фермента и увеличивающихся количеств эквимолярной смеси всех семи субъединиц σ показали, что σ⁷⁰ является самой сильной субъединицей с точки зрения связывания с кор-ферментом, за которым следуют σ^N, σ^F, σ^E/ σ^FecI, σ^H и σ^S в порядке убывания. Порядок сродства ферментов, связывающих ядро, между σ⁷⁰ и σ^N и между σ⁷⁰ и σ^H был подтвержден измерением замены одной связанной с ядром σ другой субъединицей σ. Взятые вместе с внутриклеточными уровнями σ, мы попытались оценить количество каждой формы холофермента в растущих клетках E.coli.

Введение

Бактериальная РНК-полимераза состоит из кор-фермента (состав субъединицы α₂ββ') с каталитической активностью полимеризации РНК и одного из множества видов субъединицы σ для распознавания промотора (1–6). В Escherichia coli известны семь различных видов субъединиц σ⁷⁰, σ^N (также называемых σ⁵⁴), σ^S (σ³⁸), σ^H (σ³²), σ^F (σ²⁸), σ^E (σ²⁴) и σ^FecI, каждая из которых направляет транскрипцию определенного набора генов. Большинство генов, связанных с ростом и «домашним хозяйством», экспрессируемых в экспоненциальной фазе клеточного роста, транскрибируются холоферментом, содержащим σ⁷⁰ (продукт гена rpoD), тогда как холофермент Eσ^S необходим для транскрипции некоторых генов, специфичных для стационарной фазы (7, 8). Гены ответа на стресс транскрибируются холоферментами РНК-полимеразы, содержащими альтернативные минорные σ-субъединицы. Холофермент Eσ^N транскрибирует гены, которые регулируются доступностью азота (9) и некоторых генов ответа на стресс (10); холофермент Eσ^H транскрибирует гены белков теплового шока (4,10); Eσ^F необходим для экспрессии генов жгутиков и хемотаксиса (11); холофермент Eσ^E отвечает за транскрипцию генов для экстрацитоплазматических функций, а также за реакцию теплового шока (12–14); продукт гена fecI, который первоначально был идентифицирован как регуляторный ген для транспортной системы цитрата железа (15), теперь известен как новый член подсемейства факторов экстрацитоплазматической функции (ECF) на основе последовательности белка (далее упоминаемой как σ^FecI) и участвует в транскрипционной регуляции генов для экстрацитоплазматических функций (16–18). Мы очистили все семь видов субъединицы E.coli и проанализировали их специфичность распознавания для различных промоторов E.coli (18–20). Используя специфические антитела, полученные против очищенных σ-белков, мы также измерили внутриклеточные концентрации всех семи σ-субъединиц как для экспоненциальной, так и для стационарной фазы культур E.coli W3110 (A) (20–22).

Считается, что глобальная структура транскрипции генов определяется путем конкуренции между доступными субъединицами σ (23-25), и, если это так, то замена одной σ-субъединицы, связанной с кор-ферментом, на другую должна быть главным определяющим фактором в изменении глобальной структуры транскрипции (рассматривается в 26,27). Фактически, изменение глобальной транскрипционной картины при переходе фазы роста из экспоненциальной в стационарную (21,22) или при внезапном воздействии теплового удара (28,29) сопровождается изменением внутриклеточных уровней субъединиц σ. Однако в настоящее время остается неясным, могут ли изменения только в концентрациях σ объяснить изменение транскрипционной картины. Чтобы получить представление о механизме переключения σ, мы провели качественное сравнение связывающих свойств всех семи субъединиц E.coli σ для одного и того же кор-фермента. На основе этого первого систематического сравнения связывающего сродства каждой субъединицы σ для кор-фермента вместе с определением внутриклеточных концентраций каждой субъединицы σ (20-22) была сделана попытка оценить общее количество каждого холофермента в E.coli. На основании этих наблюдений оценивается модель конкуренции σ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сверхэкспрессия и очистка субъединиц σ

Сверхэкспрессию σ⁷⁰, σ^N, σ^S, σ^F, σ^H, σ^E и σ^FecI проводили с использованием плазмид экспрессии pGEMD (30), pKES259 (31), pETF (18), pETSF (19), pET21H (S.Kusano и A.Ishihama, неопубликованные результаты), pRPOE (32) и pETFecI (20), соответственно. Штамм Escherichia coli BL21 (DE3) трансформировали соответствующей плазмидой экспрессии σ и выращивали в среде Luria-Bertani (LB), содержащей ампициллин (0,2 мг/мл). После индукции изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (IPTG) клетки собирали, промывали 10 мМ трис-HCl, pH 8,0, 1 мМ EDTA и 150 мМ NaCl и хранили при -80 ° C до использования. Клетки ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА и 0,1 мМ NaCl) и обрабатывали фенилметилсульфонилфторидом (PMSF), лизоцимом и дезоксихолатом натрия. Лизат гомогенизировали путем мягкой обработки ультразвуком, а нерастворимые вещества извлекали центрифугированием. Все семь σ-белков были извлечены из телец включения с помощью элюирующего буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ DTT и 5% глицерина), содержащего 0,5% Тритон Х-100 или 0,5 М KCl. Очистку солюбилизированных σ-субъединиц проводили без использования денатурирующих белков, по существу, как описано ранее (30).

Концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белка Брэдфорда (Bio-Rad), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Относительное содержание каждой субъединицы σ в очищенных пробах оценивали путем измерения интенсивности окрашивания Кумасси бриллиантовым синим (CBB) σ полос после отделения загрязняющих белков при помощи SDS-PAGE. Очищенные σ-субъединицы хранили замороженными при -80°С в буфере для хранения [50 мМ Трис-HCl (рН 7,6 при 4°С), 10 мМ ацетата магния, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 0,2 М KCl и 50% (v/v) глицерин] до использования.

РНК-полимеразный кор-фермент

РНК-полимеразу очищали из E.coli W3350, а кор-фермент очищали, пропуская очищенную РНК-полимеразу три раза через фосфоцеллюлозную колонку. Повторение колоночной хроматографии на фосфоцеллюлозе, по крайней мере, три раза было необходимо для полного удаления минорных субъединиц σ из кор-фермента (33,34). Уровень оставшихся субъединиц σ был дважды проверен путем тестирования транскрипционной активности in vitro, направленной специфическими промоторами, и путем иммуноокрашивания антителами, индуцированными против каждой субъединицы σ. Очищенный кор-фермент, хранили замороженным при -80°С в буфере для хранения [50 мМ Трис-HCl (рН 7,6 при 4°С), 10 мМ ацетата магния, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 0,2 М KCl и 50% (v/v глицерин] до использования.