Переключение одной кор-фермент-связанной σ на другую σ-субъединицу

Исходя из сродства связывания каждой субъединицы σ, как указано выше, мы можем предсказать эффективность замены одной σ-субъединицы, связанной с кор-ферментом, другой σ-субъединицей. Здесь мы протестировали две крайние комбинации: (i) σ⁷⁰ и σ^H, которые имеют в 10 раз более низкое сродство связывания с кор-ферментом, чем σ⁷⁰; и (ii) σ⁷⁰ и σ^N, которые имеют сродство связывания с кор-ферментом вплоть до σ⁷⁰. Эквимолярную смесь кор-фермента (20 пмоль) и одной субъединицы σ (20 пмоль) инкубировали до равновесия и затем добавляли эквимолярное количество (20 пмоль) второй субъединицы σ. В различные моменты времени после добавления второй σ-субъединицы измеряли концентрацию σ-связанной с ферментом субъединицы. Результаты конкурентных экспериментов с σ⁷⁰ / σ^H показали, что: замещение связанного с ферментом σ⁷⁰ при добавлении σ^H было мало даже после 600-минутной инкубации (рис. 4А); связанный с кор-ферментом σ^H был быстро заменен на σ⁷⁰ в течение 10 минут (рис. 4В). С другой стороны, в конкурентном эксперименте между σ⁷⁰ и σ^N ≈30% σ70, свяязанного с кор-ферментом, было заменено добавленным σ^N (рис. 4C), в то время как по меньшей мере половина σ^N, связанного с кор-ферментом, оставалась связанной даже после длительной инкубации в течение 600 минут после добавления σ⁷⁰ (рис. 4D). Все эти результаты находятся в хорошем согласии с различиями в сродстве связывания кор-фермента между σ⁷⁰ и σ^H и между σ⁷⁰ и σ^N (рис. 3; см. также таблицу 1). Более того, небольшая разница в скорости замены σ между двумя комбинациями, Eσ⁷⁰ / Eσ^N (30% на рис. 4C) и Eσ^N / Eσ⁷⁰ (50% на рис. 4D), отражает небольшую разницу в сродстве связывания с кор-ферментом между σ⁷⁰ и σ^N (см. рис. 3).

Обсуждения

Различие в сродстве связывания с кор-ферментом среди семи субъединиц E.coli

Сравнение сродства связывания с кор-ферментом среди семи субъединиц σ из E.coli указывает на то, что субъединица σ⁷⁰ имеет наибольшее сродство с кор-ферментом для транскрипции генов роста и «домашнего хозяйства». Разница между сродством σ⁷⁰ (0,26 нМ) и σ^S (с самой слабой связывающей активностью (4,28 нМ)) была в 16 раз меньше (см. Таблицу 1). Эта оценка проводилась при таких условиях, что содержание функциональных молекул σ в отношении связывания с кор-ферментом было одинаковым для семи препаратов субъединиц σ. Однако, некоторые молекулы σ неактивны при связывании с кор-ферментом при проведении полного цикла транскрипции. Например, в случае субъединицы σ⁷⁰ содержание транскрипционно компетентных молекул составляло ~ 50%, что измерялось уровнем синтеза матричной РНК lacUV5 в однократном анализе транскрипции. Это значение полностью функциональной субъединицы σ⁷⁰ представляет собой минимум, потому что: (i) определенная доля комплексов инициации с Eσ⁷⁰ становится неудавшейся до выхода промотора (уровень неудачной инициации зависит от природы промотора) (см., например, 35); (ii) некоторые транскрипционно неактивные Eσ⁷⁰, как определено с помощью анализа транскрипции, направленной на промотор lacUV5, могут быть активными с промоторами, отличными от lacUV5. Точная оценка функциональных молекул более сложна для других σ-субъединиц, потому что доступные промоторы, распознаваемые этими σ-субъединицами, ограничены и мы не знаем соотношения продуктивной и абортивной инициации транскрипции in vitro, катализируемой каждым холоферментом. Однако мы позаботились о том, чтобы получить остальные шесть субъединиц σ в такой же активной форме, как и субъединица σ⁷⁰, используя те же процедуры для экспрессии и очистки белка, что и для субъединицы σ⁷⁰. В результате все используемые препараты были полностью активны в связывании с кор-ферментом.

Чистота семи субъединиц σ находилась в диапазоне от 90 до 98%, что определялось окрашиванием SYPRO Orange (SYPRO Orange - флуоресцентный краситель мероцианинового типа, который используется для окрашивания белка в процессе определения характеристик белка), которое столь же чувствительно, как окрашивание серебром. Загрязнение σ-препаратов анти-σ факторами Rsd (36), FlgM (37) и Rse (38,39) может привести к снижению концентрации функциональных молекул σ или интерференции взаимодействия с σ-ферментом. Однако иммуноблот-анализ (аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков) препаратов σ, использованных в этом исследовании, не дал никакого сигнала против антител, анти-Rsd и анти-FlgM (данные не представлены).

Определенное значение K_d (0,26 нМ) для σ⁷⁰ немного ниже, чем предыдущее (0,5–1,0 нМ) с использованием методов ВЭЖХ гель-фильтрации и флуоресценции (40). Разница может быть связана с различием в содержании функциональной субъединицы σ⁷⁰ и/или кор-фермента или в условиях анализа. Joo и соавторы (41) определили значение K_d 1 нМ для σ^H в эксперименте насыщения σ при транскрипции in vitro, а значение 100 нМ при центрифугировании в градиенте глицерина. Константы связывания, полученные посредством гель-фильтрации и центрифугирования в градиенте глицерина, должны быть ниже, чем полученные в анализах транскрипции, из-за эффекта разбавления при отделении связанной с кор-ферментом σ от несвязанной свободной σ. Таким образом, необходимы дальнейшие технические усовершенствования для точного определения сродства связывания каждой субъединицы σ для кор-фермента, но настоящее исследование обеспечивает относительный порядок сродства связывания кор-фермента среди семи σ-субъединиц E.coli. Настоящее исследование ясно показывает, что сродство σ^N-субъединицы к кор-ферменту так же высоко, как и у других σ-субъединиц. Таким образом, АТФ-зависимая реакция в образовании открытого комплекса Eσ^N-промотор может быть на стадии после связывания холофермента Eσ^N с промотором.