Соперничество между семью субъединицами за кор-фермент

Для сравнения сродства связывания кор-ферментов между семью σ субъединицами E. coli мы очистили все остальные шесть субъединиц σ от сверхэкспрессированных клеток E. coli до кажущейся однородности (рис. 2А). Чтобы восстановить все семь субъединиц σ в активных формах, была предпринята попытка очистить σ субъединицы той же самой процедурой от сверхэкспрессированных клеточных экстрактов, т. е. извлечение σ белков из фракции гранул сверхэкспрессированных клеточных экстрактов с использованием буфера солюбилизации, содержащего неионный детергент, без использования ионных детергентов. Концентрацию каждой субъединицы σ определяли после коррекции на чистоту (90-98%), согласно оценке SDS-PAGE с последующим окрашиванием CBB. Так как все эти очищенные субъединицы σ полностью превращались в соответствующие холоферменты путем добавления избыточных количеств кор-фермента (данные не показаны), используемые препараты σ были полностью активны, по крайней мере, в связывании с кор-ферментом.

Используя очищенные субъединицы σ, мы сначала проанализировали кривую насыщения каждой субъединицы σ, чтобы преобразовать фиксированное количество (20 пмоль) кор-фермента в соответствующий холофермент. При входном молярном соотношении 1 более 80% входного кор-фермента было преобразовано в холофермент для пяти субъединиц σ: σ⁷⁰, σ^N, σ^F, σ^E и σ^FecI, а 60-65% входного кор-фермента было преобразовано в холофермент для σ^S и σ^H (данные не показаны). Для насыщения σ входного кор-фермента требовалось более высокой концентрации как для σ^S, так и для σ^H. Входной кор-фермент насыщали добавлением 2-кратного молярного избытка σ даже для σ^S и σ^H, со слабым сродством связывания. Аналогичный порядок активности σ был получен при определении уровня функционального холофермента путем измерения кривой насыщения σ с использованием транскрипционных тестов in vitro, направленных специфическими промоторами для каждой субъединицы σ (данные не показаны). Однако при наличии единичных σ-добавок было трудно определить небольшое различие в сродстве связывания кор-фермента между семью σ-субъединицами.

Д ля того чтобы измерить относительное сродство связывания кор-фермента между семью субъединицами σ, мы провели смешанный эксперимент восстановления в присутствии всех семи субъединиц σ в одной и той же реакционной смеси. К 20 пмоль кор-фермента добавляли увеличивающиеся количества эквимолярной смеси всех семи субъединиц σ, а субъединицы σ фракционировали на связанные с кор-ферментом и несвязанные фракции методом гель-фильтрационной колоночной хроматографии (рис. 2B). После измерения молярных соотношений между α-субъединицей и каждой σ-субъединицей в пике холофермента определяли основные связанные с ферментом σ-субъединицы. Почти 68% кор-фермента было преобразовано в холоферменты при входном молярном отношении 0,25 для каждой субъединицы σ (или 1,75 для комбинированных субъединиц σ) (рис. 3А) и >90% входного кор-фермента связывалось с одной из семи субъединиц σ при входном молярном отношении 1,0 для каждой субъединицы σ (или 7,0 для комбинированных субъединиц σ) (рис. 3Б). Входной фермент ядра насыщался одной из субъединиц σ при входном молярном отношении 2,0 для каждой субъединицы σ (или 14 для комбинированных субъединиц σ) (рис. 3С). Однако кор-фермент-связанная фракция существенно отличалась среди семи субъединиц σ. При низкой концентрации σ (или уровне насыщения 60-70%) σ^N проявлял сродство столь же высокое, как и субъединица σ⁷⁰, а комбинированный уровень Eσ^N и Eσ⁷⁰ достигал 60% от общего количества холоферментов. Уровень холоферментов был почти одинаковым среди Eσ^F, Eσ^FecI и Eσ^E, каждый из которых составлял 14, 10 и 8% соответственно, в то время как количество Eσ^H составлял <1% от общего количества холоферментов. Уровень образования Eσ^S был самым низким при использованных условиях восстановления. Фракции, связанные с кор-ферментом, увеличивались параллельно для всех семи субъединиц σ одновременно с увеличением входных субъединиц σ до фиксированного количества основного фермента (рис. 3B и C).

При насыщении порядок кор-фермент-связанных субъединиц σ составлял σ⁷⁰ > σ^N > σ^F > σ^H/σ^FecI > σ^E > σ^S. В условиях насыщения σ доля холофермента Eσ⁷⁰ составляла ∼39% от общего количества холоферментов. Отсюда мы заключаем, что в условиях конкурентного связывания в присутствии всех семи субъединиц σ сродство σ⁷⁰ является самым сильным, а сродство σ^S-самым слабым. Судя по разнице сродства (>16 раз) в связывании кор-фермента между σ⁷⁰ и σ^S и значению K_d = 0,26 нм для σ⁷⁰ (см. выше), мы оцениваем, что кажущееся значение K_D для σ^S с кор-ферментом составляет ≈ 4,3 нм (табл.1).

σ subunit		Kd (nM)a	Core binding affinity	Intracellular concentrationb		Holoenzyme ratioc (%)
				(fmol/mg protein)	(molecules/cell)
σ70 (σD)		0.26	1.0	160	700	78
σ54 (σN)		0.30	1.55	25	110	8
σ38 (σS)		4.26	16.4	<1	<1	0
σ32	(σH)	1.24	4.75	2.1	<10	0
σ28	(σF)	0.74	2.85	85	370	14
σ24	(σE)	2.43	9.35	1.4	<10	0
σ18	(σFecI)	1.73	6.65	<1	<1	0