berezov1

новлено, что ДНК локализована в ядре клетки, в то время как синтез белка протекает главным образом в микросомах цитоплазмы. Первые экспериментальные доказательства необходимости нуклеиновых кислот для синтеза белка были получены в лаборатории Т. Касперсона. Было показано также, что присутствующие в цитоплазме рибонуклеиновые кислоты контролируют синтез цитоплазматических белков. Таким образом, уже тогда вырисовывалась картина тесной связи между ДНК, локализованной в ядре *, и синтезом белка, протекающим в цитоплазме и регулирующимся рибонуклеиновыми кислотами, которые были открыты как в цитоплазме, так и в ядре. На основании этих чисто морфологических данных было сделано заключение, полностью подтвержденное в настоящее время, что биосинтез белка, хотя непосредственно и регулируется рибонуклеиновыми кислотами, опосредованно связан с контролирующим влиянием ДНК ядра и что РНК сначала синтезируется в ядре, затем поступает в цитоплазму, где выполняет роль матрицы в синтезе белка. Полученные значительно позже экспериментальные данные подтвердили гипотезу о том, что основными функциями нуклеиновых кислот являются хранение генетической информации и реализация этой информации путем программированного синтеза специфических белков.

В последовательности ДНК—>РНК—>Белок недоставало сведений о том, каким образом происходят расшифровка наследственной информации и синтез специфических белков, определяющих широкое разнообразие признаков живых существ. В настоящее время выяснены основные процессы, посредством которых осуществляется передача наследственной информации: репликация, т.е. синтез ДНК на матрице ДНК; транскрипция, т.е. синтез РНК на матрице ДНК или перевод языка и типа строения ДНК на молекулу РНК (см. ранее), и трансляция–процесс, в котором генетическая информация, содержащаяся в молекуле мРНК, направляет синтез соответствующей аминокислотной последовательности в белке. Напомним, однако, что многие тонкие механизмы транскрипции и трансляции окончательно еще неясны.

ТРАНСЛЯЦИЯ И ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К СИНТЕЗУ БЕЛКА В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Непосредственное отношение к механизмам передачи наследственной информации, или экспрессии генов, имеет процесс трансляции, означающий перевод «четырехбуквенного языка нуклеиновых кислот на двадцатибуквенную речь белков». Другими словами, трансляция сводится к синтезу белка в рибосомах. В этом процессе только последовательность расположения нуклеотидов в мРНК определяет первичную структуру белка, т.е. строго упорядоченную последовательность расположения отдельных аминокислотных остатков в молекуле синтезируемого белка.

Остановимся на анализе тех условий, которые необходимы для осуществления синтеза белка в бесклеточной системе. В современных представлениях о синтезе белка выдающуюся роль сыграли три экспериментальных подхода, разработанные в начале 50-х годов. Во-первых, в классических исследованиях П. Замечника и сотр. при использовании меченых

* Получены экспериментальные доказательства наличия ДНК также в митохондриях (около 1-2% от суммарной ДНК клеток). Она негомологична и некомплементарна ядерной ДНК. Установлено, что ДНК кодирует синтез некоторых структурных белков самих митохондрий и особых митохондриальных РНК.

511

Таблица 14.1. Состав белоксинтезирующей системы у про- и эукариот в разные

стадии синтеза белка

512

аминокислот был впервые решен вопрос о месте синтеза белка; им оказалась рибосома. При введении крысам 15N-аминокислот и определении радиоактивности белков в различных субклеточных фракциях печени, полученных методом дифференциального центрифугирования через различные промежутки времени, было показано, что радиоактивная метка в первую очередь появляется во фракции микросом и лишь затем в других субклеточных образованиях. Во-вторых, добавление АТФ к белоксинтезирующей системе цитозоля вызывало «активирование» аминокислоты и связывание ее с термостабильной и растворимой формой РНК, впоследствии названной транспортной (тРНК), что приводило к образованию комплекса, названного позже аминоацил-тРНК. Ферменты, катализирующие этот процесс, сейчас называются аминоацил-тРНК-синтетазами. В-третьих, выяснена роль самих адапторных РНК в процессе трансляции.

Дальнейшие исследования были направлены на поиск других компонентов белоксинтезирующей системы.

Белоксинтезирующая система включает набор всех 20 аминокислот, входящих в состав белковых молекул; минимум 20 разных тРНК, обладающих специфичностью к определенному ферменту и определенной аминокислоте; набор минимум 20 различных ферментов–аминоацил- тРНК-синтетаз, также обладающих двойной специфичностью к какой-либо определенной аминокислоте и к одной тРНК; рибосомы (точнее, полисомы, состоящие из 4–12 монорибосом с присоединенной к ним мРНК); АТФ и АТФ-генерирующую систему ферментов; ГТФ, принимающий специфическое участие в стадиях инициации и элонгации синтеза белка в рибосомах; ионы Mg2+ в концентрации 0,005–0,008 М; мРНК в качестве главного компонента системы, несущей информацию о структуре белка, синтезирующегося в рибосоме; наконец, белковые факторы, участвующие в синтезе на разных уровнях трансляции. Основные компоненты белоксинтезирующей системы про- и эукариотов в разные стадии синтеза белка обобщены в табл. 14.1.

Рассмотрим более подробно структуру и функцию главных компонентов белоксинтезирующей системы.

Рибосомы

Как известно, живые организмы в зависимости от структуры клеток делятся на две группы–прокариоты и эукариоты. Первые не содержат ограниченного мембраной ядра и митохондрий или хлоропластов; они представлены главным образом микроорганизмами. Клетки эукариот животных и растений, включая грибы, напротив, содержат ядра с мембранами, а также митохондрии (в ряде случаев и хлоропласты) и другие субклеточные органеллы.

Оба типа клеток имеют рибосомы, причем рибосомы эукариот (мол. масса 4,2•106) значительно большего размера (23 нм в диаметре), чем рибосомы прокариот (мол. масса 2,5•106, 8 нм в диаметре). Обычно рибосомы характеризуют по скорости их седиментации в центрифужном поле, которая количественно выражается константой седиментации s в единицах Сведберга S (см. главу 1). Величина s зависит не только от размера частиц, но и от формы и плотности, так что она непропорциональна размеру. Число рибосом в микробной клетке равно примерно 104, а эукариот–около 105.

Химически рибосомы представляют собой нуклеопротеины, состоящие из РНК и белков, причем 80S рибосомы эукариот содержат примерно

513

Прокариоты Эукариоты

70S 80S

~ 49 белков

Рис. 14.2. Компоненты рибосом прокариот и эукариот (схема).

равное их количество, а у 70S рибосом прокариот соотношение РНК и белка составляет 65% и 35% соответственно (рис. 14.2). РНК рибосом принято называть рибосомными и обозначать рРНК. Как 80S, так и 70S рибосомы состоят из двух субчастиц, которые можно увидеть под электронным микроскопом или после обработки рибосом растворами, содержащими низкие концентрации ионов Mg2+. При этих условиях рибосомы диссоциируют на субчастицы; последние могут быть отделены друг от друга методом ультрацентрифугирования. Одна из субчастиц по размерам в 2 раза превышает вторую. Так, у 70S рибосом величины s для субчастиц равны 50S и 30S, у 80S рибосом–соответственно 60S и 40S (см. рис. 14.2). Укажем также, что у Е. coli большая и малая субчастицы содержат 34 белка и 21 белок соответственно и, кроме того, 2 молекулы рРНК с коэффициентами седиментации 23S и 5S в большой и одну молекулу рРНК (16S) в малой субчастице. Рибосомные белки не только все выделены, но и секвенированы; отличаются большим разнообразием молекулярной массы (от 6000 до 75000). Считается, что все 55 бактериальных рибосомных белков участвуют в синтезе полипептидов в качестве ферментов или структурных компонентов, но, за исключением небольшого числа, детальная функция большинства из них не выяснена. РНК 23S и 5S содержат 3200 и 120 нуклеотидов соответственно, a 16S РНК–1540 нуклеотидов. Субчастицы рибосом клеток эукариот построены более сложно. В их составе четыре разные рРНК и более 70 разных белков в обеих субчастицах, при этом большая субчастица (60S) содержит три разного размера рРНК: 28S (4700 нуклеотидов), 5,8S (160 нуклеотидов) и 5S (120 нуклеотидов)–и около 49 белков. Малая субчастица (40S) содержит всего одну молекулу 18S рРНК и около 33 белков. Укажем также, что биологические функции компонентов эукариотических рибосом также связаны, вероятнее всего, с синтезом полипептидной цепи, но их конкретная роль недостаточно раскрыта.

514

Рибосомы представляют собой сложную молекулярную «машину» («фабрику») синтеза белка. Для выяснения тонких механизмов синтеза белка в рибосомах необходимы более точные сведения о структуре и функциях всех компонентов рибосом. В последнее время получены данные, свидетельствующие о вероятной пространственной трехмерной структуре как целых рибосом, так и их субчастиц. В частности, выяснено, что форму и размеры 30S и 40S субчастиц рибосом предопределяют не белковые молекулы этих частиц, а третичная структура входящих в их состав 16S и 18S рРНК. Более того, по данным акад. А.С. Спирина, для сохранения пространственной морфологической модели всей 30S субчастицы оказалось достаточным наличие только двух белков (из 21), содержащихся в определенных топографических участках молекулы 16S рРНК.

Известно, что рРНК образуется из общего предшественника всех типов клеточных РНК, в свою очередь синтезирующегося на матрице ДНК в ядре (см. главу 13). Рибосомные белки имеют цитоплазматическое происхождение, затем они транспортируются в ядрышки, где и происходит спонтанное образование рибосомных субчастиц путем объединения белков с соответствующими рРНК. Объединенные субчастицы вместе или врозь транспортируются через поры ядерной мембраны обратно в цитоплазму, где группа рибосом вместе с мРНК образует полисомы или полирибосомы, принимающие непосредственное участие в синтезе белка.

Аминоацил-тРНК-синтетазы

Экспериментально доказано существование в любых клетках живых организмов специфических ферментов, катализирующих активирование аминокислот и связывание последних с определенными тРНК. Все эти ферменты выделены в чистом виде из Е. coli, секвенированы, и для ряда их установлена трехмерная структура.

Все они оказались чувствительными к реагентам на SH-группы и требуют присутствия ионов Mg2+. Ферменты обладают абсолютной специфичностью действия, поскольку они узнают только одну какую-либо L-аминокислоту или одну тРНК. Для тех аминокислот, для которых открыты две и более тРНК (см. далее), соответствующая аминоацил- тРНК-синтетаза катализирует аминоацилирование всех этих тРНК. Это обстоятельство чрезвычайно важно, поскольку в дальнейшем в белковом синтезе «узнавание» аминоацил-тРНК основано не на природе аминокислоты, а на химической природе антикодона тРНК. Считается, что в молекуле каждой аминоацил-тРНК-синтетазы имеется по крайней мере 3 центра связывания: для аминокислоты, тРНК и АТФ; ферменты весьма чувствительны также к аналогам аминокислот, которые ингибируют активирование соответствующих аминокислот. Некоторые ферменты состоят из одной полипептидной цепи, другие–из двух или четырех гомологичных или гетерогенных субъединиц.

Аминоацил-тРНК-синтетазы в последнее время стали делить на 2 класса в соответствии с различиями в их первичной и третичной структурах, а также в зависимости от своеобразия механизма катализируемой реакции. Первый класс включает ферменты, катализирующие синтез аминоацилтРНК следующих аминокислот: Арг, Вал, Глн, Глу, Иле, Лей, Мет, Тир, Трп, Цис; второй класс–аминокислот Ала, Асн, Асп, Гис, Гли, Лиз, Про, Сер, Тре, Фен. Оказалось, что ферменты 1-го класса обеспечивают перенос аминоацильной группы сначала ко второй 2'-ОН-группе терминального остатка адениловой кислоты, затем перемещение ее к 3'-ОН-группе (путем

515

реакции трансэтерификации), в то время как ферменты 2-го класса катализируют перенос аминоацильной группы непосредственно к 3'-ОН-группе концевого аденилового нуклеотида.

Аминоацил-тРНК-синтетазы в активном центре содержат гистидин, имидазольное кольцо которого участвует в связывании АТФ посредством ионов Mg2+. Наибольшим сродством эти ферменты, как было указано, обладают к молекулам специфических тРНК, хотя конкретный механизм, посредством которого ферменты узнают подходящую РНК, пока неясен. В то же время эти ферменты отличаются низкой молярной активностью (число оборотов не превышает нескольких сот каталитических актов в минуту).

Участок

связывания

аминокислот

а

Рис. 14.3. Структура тРНК.

а - общая структура различных тРНК; б - пространственная структура тРНК.

516

Печень

Дрожжи

Рис. 14.4. Созревание валиновой тРНК (по А.А. Баеву). Цифрами обозначены фрагменты молекулы тРНК.

Транспортные РНК

В лаборатории М. Хогланда было выяснено, что при инкубации 14С-аминокислоты с растворимой фракцией цитоплазмы в присутствии АТФ и последующим добавлением трихлоруксусной кислоты в образовавшемся белковом осадке метка не открывается. Эти данные позволили сделать заключение, что меченая аминокислота не включается в белковую молекулу. Метка оказалась связанной ковалентно с РНК, содержащейся в безбелковом фильтрате. Дальнейшие исследования показали, что РНК, к которой присоединяется меченая аминокислота, имеет небольшую молекулярную массу и сосредоточена в растворимой фракции, поэтому ее сначала назвали растворимой, а позже адапторной, или транспортной, РНК (тРНК). На долю тРНК приходится около 10–15% от общего количества клеточной РНК. К настоящему времени открыто более 60 различных тРНК. Для каждой аминокислоты в клетке имеется по крайней мере одна специфическая тРНК. (Для ряда аминокислот открыто более одной: в частности, для серина, лейцина и аргинина–6 разных тРНК, для аланина, треонина и глицина–по 4 разных тРНК, хотя и в этом случае каждая тРНК связана со специфической аминоацил-тРНК-синтетазой.) Молекулярная масса большинства тРНК колеблется от 24000 до 29000. Они содержат от 75 до 85 нуклеотидов, в том числе 8 и более из них являются модифицированными основаниями. Аминокислоты присоединяются в конечном итоге к свободной 3'-ОН-группе (см. ранее о ферментах аминоацил- тРНК-синтетаз 1-го класса) концевого мононуклеотида, представленного во всех тРНК АМФ (адениловая кислота), путем образования эфирной связи. Интересно, что почти все тРНК обладают не только удивительно сходными функциями, но и очень похожей трехмерной структурой (рис. 14.3).

Установлена первичная структура почти всех 60 открытых тРНК (рис. 14.4). Знание последовательности нуклеотидов и, следовательно, состава тРНК дало в руки исследователей много ценных сведений о биологической роли отдельных компонентов тРНК. Общей для тРНК оказалась также нативная трехмерная структура, установленная методом

517

рентгенокристаллографического анализа и названная первоначально конформацией клеверного листа; на самом деле эта конформация имеет перевернутую L-образную форму (см. рис. 14.3). Определение тРНК этим методом позволило выявить ряд отличительных особенностей структуры. В молекуле тРНК открыты спирализованные участки, необычные водородные связи и гидрофобные взаимодействия во внеспирализованных участках. Показано, что тРНК имеет псевдоуридиловую петлю, образованную из нуклеотидов, содержащих псевдоуридин (ТψС), и дигидроуридиловую петлю. Обе петли участвуют в образовании угла буквы L. На 3'-ОН-конце располагается одинаковая для всех тРНК последовательность триплета ЦЦА-ОН, к которой присоединяется посредством эфирной связи специфическая аминокислота. Связывание в основном происходит через 3'-ОН-группу концевого аденилового нуклеотида, хотя, как было указано, получены доказательства возможности предварительного присоединения аминокислоты и через его 2'-ОН-группу.

Роль отдельных участков тРНК недостаточно раскрыта. В частности, псевдоуридиловая петля, по-видимому, обеспечивает связывание амино- ацил-тРНК с рибосомой, а дигидроуридиловая петля, вероятнее всего, необходима как сайт (место) для узнавания специфическим ферментом – аминоацил-тРНК-синтетазой. Имеется, кроме того, добавочная петля, состав которой варьирует у разных типов молекул тРНК; ее назначение неизвестно. Существенным, с полностью раскрытой функцией участком является антикодоновая петля, несущая триплет, названный антикодоном, и расположенная на противоположной стороне от того конца, к которому присоединяется аминокислота. Антикодоновая петля состоит из 7 нуклеотидов: три занимают центральное положение и формируют собственный высокоспецифичный антикодон, по два нуклеотида расположены по обе стороны от него, включая модифицированный пурин и варьирующее основание с одной стороны и два пиримидиновых осно- вания–с другой стороны. Антикодон является специфичным и комплементарным к соответствующему кодону мРНК, причем оба они антипараллельны в своей комплементарности.

Тщательный анализ нуклеотидной последовательности разных тРНК показал, что все они содержат одинаковый 5'-концевой нуклеотид–ГМФ – со свободной 5'-фосфатной группой. Адапторная функция молекул тРНК заключается в связывании каждой молекулы тРНК со своей специфической аминокислотой. Однако, поскольку между нуклеиновой кислотой и специфической функциональной группой аминокислот нет соответствия и сродства, эту функцию узнавания, точнее, посредника между тРНК и аминокислотой, должна выполнять белковая молекула фермента. Взаимодействие между аминоацил-тРНК-синтетазой и тРНК принято обозначать как «вторичный генетический код», подчеркивая тем самым его ключевую роль в обеспечении точности синтеза белка, причем правила кодирования являются, вероятнее всего, более сложными, чем правила «первичного» генетического кода (см. далее).

Матричная РНК

Ранее было указано на необходимость участия предобразованной молекулы РНК для правильной расстановки аминокислот в полипептидной цепи. Еще сравнительно недавно предполагали, что такой молекулой может служить рРНК. Это предположение как будто бы подкреплялось и опытами по заражению клеток Е. coli ДНК фага. Оказалось, что немедленно после

518

заражения синтез нормальных клеточных ДНК прекращается и начинается интенсивный синтез фаговой ДНК. Более того, весь белоксинтезирующий аппарат клеток перестраивался на синтез только фаговых белков. Состав синтезированных фаговых белков отличался от состава белков бактерии. Было высказано предположение, что при заражении фагом, очевидно, меняется последовательность оснований в РНК, однако и эта гипотеза не подтвердилась. По мнению ряда известных ученых, предобразованная РНК, необходимая для изменения типа синтезируемого белка, должна обладать высокой скоростью обновления своего состава, т.е. молекула такой РНК должна синтезироваться и распадаться с такой скоростью, чтобы обеспечить подобную скорость обновления нуклеотидного состава. Фактически рРНК оказалась метаболически малоактивной и весьма стабильной, поэтому становилось очевидным, что она не может служить

вкачестве матрицы.

Вряде лабораторий (в частности, в лаборатории С. Бреннера) были

получены данные о возможности существования в клетках в соединении с рибосомами короткоживущей РНК *, названной информационной (иРНК). Сейчас она обозначается как матричная РНК (мРНК), потому что ее роль заключается в переносе информации от ДНК в ядре (где она синтезируется под действием ДНК-зависимой РНК-полимеразы) до цитоплазмы, где она соединяется с рибосомами и служит матрицей, на которой осуществляется синтез белка. Эта блестящая гипотеза затем экспериментально была доказана в лаборатории М. Ниренберга. При изучении влияния различных фракций клеточной РНК на способность рибосом, выделенных из Е. coli, к синтезу белка было установлено, что некоторые из них стимулировали включение 14С-аминокислот в синтезируемый полипептид. Добавление синтетического полинуклеотида, в частности полиуридиловой кислоты (поли-У), в белоксинтезирующую систему приводило к включению в синтезирующуюся белковую молекулу единственной аминокислоты – фенилаланина. Поли-У вызывал синтез в бесклеточной системе необычного полипептида полифенилаланина. Таким образом, искусственно синтезированный полирибонуклеотид, добавленный к препаратам рибосом, включавшим известные к тому времени факторы белкового синтеза и источники энергии, вызывал синтез определенного, запрограммированного полипептида.

Эти опыты открыли возможность для экспериментальной расшифровки всего генетического кода, при помощи которого информация от РНК передается на синтезируемый белок. Последовательность нуклеотидов РНК реализуется в специфической последовательности аминокислот синтезируемой полипептидной цепи. Опыты М. Ниренберга свидетельствуют также о том, что не рибосома и не рибосомная рРНК являются матрицей, на которой синтезируются специфические белки, а эту роль выполняют поступающие извне матричные РНК. Итак, ДНК передает информацию на РНК, которая синтезируется в ядре и затем поступает в цитоплазму; здесь РНК выполняет матричную функцию для синтеза специфической белковой молекулы. Матричная гипотеза белка, как и других полимерных молекул ДНК и РНК (см. ранее), в настоящее время получила подтверждение. Ее правомочность была доказана в экспериментах, которые обеспечивали точное воспроизведение первичной структуры полимерных молекул. Этот

* Впервые на возможность существования в клетках быстро обменивающейся молекулы РНК было указано в работах А.Н. Белозерского и А.С. Спирина.

519

синтез в отличие от малоуправляемого химического синтеза отличался не только высокой скоростью и специфичностью, но и направленностью самого процесса в строгом соответствии с программой, записанной в линейной последовательности молекулы матрицы.

Природа генетического кода

Проблема синтеза белка тесно связана с понятием генетического кода. Генетическая информация, закодированная в первичной структуре ДНК, еще в ядре переводится в нуклеотидную последовательность мРНК. Вопрос о том, каким образом эта информация передается на белковую молекулу, долго не был ясен. Первые указания на существование прямой линейной зависимости между структурой гена и его продуктом – белком можно найти у Ч. Яновского. В серии изящных опытов с применением методов генетического картирования и секвенирования он показал, что порядок изменений в структуре мутантного гена триптофансинтазы у Е. coli точно соответствует порядку изменений в аминокислотной последовательности молекулы белка-фермента.

Эукариотические клетки обладают особым механизмом точного и эффективного перевода последовательности мРНК в соответствующую последовательность аминокислот синтезируемого белка. Сами молекулы мРНК не имеют сродства к аминокислотам, и было высказано предположение о том, что для перевода нуклеотидной последовательности мРНК на аминокислотную последовательность белков необходим некий посредник, названный адаптором (см. ранее). Молекула адаптора должна быть наделена способностью узнавать нуклеотидную последовательность специфической мРНК и соответствующую аминокислоту. Клетка, имеющая подобную адапторную молекулу, может встраивать каждую аминокислоту в подходящее место полипептидной цепи в строгом соответствии с нуклеотидной последовательностью мРНК. Остается, таким образом, незыблемым положение, что сами по себе функциональные группы аминокислот не способны вступать в контакт с матрицей и информационной мРНК.

Было показано, что в нуклеотидной последовательности мРНК имеются кодовые «слова» для каждой аминокислоты–генетический код. Вероятнее всего, он заключается в определенной последовательности расположения нуклеотидов в молекуле ДНК. Вопросы о том, какие нуклеотиды ответственны за включение определенной аминокислоты в белковую молекулу и какое количество нуклеотидов определяет это включение, оставались нерешенными до 1961 г. Теоретический разбор показал, что код не может состоять из одного нуклеотида, поскольку в этом случае только 4 аминокислоты могут кодироваться. Однако код не может быть и дуплетным, т.е. комбинация двух нуклеотидов из четырехбуквенного «алфавита» не может охватить всех аминокислот, так как подобных комбинаций теоретически возможно только 16 (42 = 16), а в состав белка входит 20 аминокислот. Для кодирования всех аминокислот белковой молекулы был бы достаточным триплетный код, когда число возможных комбинаций составит 64 (43 = 64).

Из приведенных данных М. Ниренберга становится очевидным, что поли-У, т.е. РНК, гипотетически содержащая остатки только одного уридилового мононуклеотида, способствует синтезу белка, построенного из остатков одной аминокислоты–фенилаланина. На этом основании был сделан вывод, что кодоном для включения фенилаланина в белковую молекулу может служить триплет, состоящий из трех уридиловых нуклео-

520