Волков Г. Л. Современные представления о системе гемостаза

ГЛАВА 1. Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз

На сегодня обнаружено достаточно много пептидов — компонентов яда змей, которые опосредуют свое действие через GPVI и могут быть хороши­ ми инструментами для изучения Ig-рецептора. К таким пептидам, напри­ мер, относятся конвульксин (лектин С-типа), который активирует GPVI, алборагин, связывающийся со специфическим центром гликопротеина. То­ ксины змеиного яда являются мультимерными и вызывают активацию тромбоцитов кластеризацией рецептора. Некоторые из них связываются с другой поверхностью гликопротеина в дополнение к GPVI: албоагрегин А связывается с GPVI и GPIb, тем самым вызывая стремительную активацию тромбоцитов. При этом взаимодействие с GPIb для активации несуществен­ но, так как албоагрегин А активирует тромбоциты Бернарда—Солера и клет­ ки линий GPVI. Несмотря на это, совершенно нормально, что токсины яда змей опосредуют свое действие связыванием с более чем одним тромбоцитар­ ным гликопротеином [109, НО].

В последние годы обнаружены антитела к GPVI, которые в случае попе­ речной прошивки вторичными антителами являются сильными тромбоци­ тарными агонистами, но отдельные из них могут быть рецепторными анта­ гонистами для самих себя. Антитела служат мощными инструментами для определения последовательности внутри экстрацеллюлярного домена GPVI, связывающейся с коллагеном.

1.5. ТРОМБОЦИТЫ И АДЕНОЗИНДИФОСФАТ

Способность АДФ индуцировать агрегацию тромбоцитов установлена в 1961 г., когда обратили внимание на то, что небольшая моле­ кула, вышедшая из красных кровяных клеток, вызывала адгезию тромбоци­ тов к стеклу и способствовала их агрегации. О ключевой роли АДФ в форми­ ровании гемостатической пробки и в патогенезе артериальных тромбозов свидетельствует следующее: 1) АДФ содержится в плотных гранулах тромбо­ цитов в высокой концентрации и высвобождается, когда тромбоциты акти­ вированы другими агентами, такими, как тромбин или коллаген; 2) ин­ гибиторы АДФ-стимулируемой агрегации тромбоцитов являются эффектив­ ными антитромботическими препаратами; 3) у пациентов с дефектами реце­ пторов АДФ или с недостатком АДФ в гранулах тромбоцитов развивается диатезное кровотечение [111].

Формирование прочного тромбоцитарного тромба в месте повреждения требует инициации и продолжения активации тромбоцитов. Инициация обычно обеспечивается коллагеном, фактором фон Виллебранда и местной генерацией тромбина, вызванной образованием комплекса тканевый фак- тор-VIIa. Продолжение активации наблюдается, когда в растущий тромб во­ влекаются новые тромбоциты, из гранул которых высвобождаются вторич­ ные агонисты — тромбоксан А2, АДФ и продукт а-гранул — Gas6. АДФ актив­ но высвобождается из плотных гранул тромбоцитов и гораздо медленнее — из поврежденных эритроцитов и эндотелиальных клеток. Добавление экзо­ генного АДФ к отмытым тромбоцитам приводит к изменению их формы, обратимой агрегации при физиологической концентрации кальция во внеш-

60

1.5. Тромбоциты и аденозиндифосфат

ней среде, и в конечном итоге к потере чувствительности. Взаимодействие тромбоцит-тромбоцит осуществляется при участии следовых количеств тромбоксана А2, который вызывает секрецию и усиление агрегации. Этот эффект достаточно сильный и может наблюдаться в случаях снижения кон­ центрации кальция во внеклеточной среде до микромолярных количеств (как в богатой тромбоцитами цитратной плазме крови).

Большинство агонистов, включая АДФ, активирует тромбоциты по­ средством рецепторов клеточной поверхности, сопряженных с гетеротримерными ГТФ-связывающими, или G-белками [112, 113]. Тромбоциты содер­ жат белки всех четырех классов G-белков: Gq, Gi? G12, Gs. Из них первые три опосредуют действия агонистов, которые активируют тромбоциты; рецепто­ ры агониста могут соединяться с одним, двумя или всеми тремя белками. Ряд процессов предотвращает неподходящую активацию тромбоцитов или ограничивает степень активации, включающую высвобожденные из эндоте­ лия PG12 и NO, которые повышают уровень тромбоцитарного цАМФ и цГМФ, а также CD39, гидролизующего АДФ до неактивного АМФ. PGI2 вызывает образование цАМФ, активируя аденилилциклазу посредством рецепторов на поверхности тромбоцитов, сопряженных с Gs (см. вклейку, рис. 10).

Воздействие АДФ приводит к изменению формы тромбоцитов, повы­ шению активности фосфолипазы С и концентрации цитозольного кальция. АДФ подавляет образование цАМФ, действие которого является критичес­ ким для активации тромбоцитов. Активация и агрегация тромбоцитов, выз­ ванные АДФ, играют основную роль в развитии и патогенезе артериальных тромбозов. Механизм активации тромбоцитов АДФ интересен с точки зре­ ния фармакологии и медицины. Тромбоциты имеют АДФ-специфичные пуринорецепторы (см. вклейку, рис. 15). Некоторые из них (Р2Х1 ионотропный рецептор и P2Y| рецептор, связанный с G-белками), которые стимулируют внутриклеточное запасание фосфорилаза С/Са2+ и/или ингибируют адени­ лилциклазу, были охарактеризованы в несколько последних лет. Рецептор P2Y1 опосредует вызываемую АДФ мобилизацию кальция. Кроме того, опи­ саны центры связывания адениннуклеотидов на гликопротеине ПЫПа. Ре­ цептор Р2Х1 опосредует вызываемый АДФ приток кальция и изменение фор­ мы тромбоцитов. Этот путь активации не включает влияние тиенопиридинов в отличие от рецептора Р2УН имеющего в своем составе семь трансмемб­ ранных доменов и связанного с ингибиторными G-белками. Он опосредует высвобождение внутриклеточного кальция, ингибирование аденилатциклазы, активацию GPHbllla и последующую агрегацию тромбоцитов. Все эти механизмы вызваны действием тиенопиридинов.

Изучение агонистов, являющихся пуриновыми производными, и антаго­ нистов функционирования тромбоцитов привело к обнаружению множества рецепторов АДФ, которые способствуют ответу тромбоцитов на действие АДФ. Одним из них является ионный канал, или P2Xi, который активирует­ ся аналогом АДФ — а,р-МеАТФ, способствующим притоку внеклеточного кальция. Другой аналог АТФ — ARL-66096 (в настоящее время доказано, что его антагонист — P2Y12) блокирует как АДФ-стимулируемую агрегацию

61

ГЛАВА 1. Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз

тромбоцитов, так и ингибирование аденилилциклазы, однако в той же концентрации не может ингибировать активацию фосфолипазы С или из­ менение формы тромбоцитов. До того как были обнаружены рецепторы, раз­ ные исследователи выдвинули предположение о существовании на тромбо­ цитах двух G-белоксопряженных рецепторов АДФ, один из которых инги­ бирует синтез цАМФ (посредством белков семейства G,), а другой — акти­ вирует фосфолипазу С и вызывает изменение формы тромбоцитов (через Gq И С|2).

Для агрегации тромбоцитов требуется активация как Gr, так и Gq-onoc- редованного пути. Интересно, что АДФ является агонистом, выполняющим эту задачу для обоих рецепторов, один из которых сопряжен с Gq, но не с Gs, а другой — с Gj, но не с Gq [114].

Gq-сопряженный рецептор АДФ — P2Y| — ответственный за изменение формы тромбоцитов и мобилизацию кальция. Тромбоциты мыши, у которых отсутствует а-субъединица Gq-белка, обнаруживают связанные с АДФ дефек­ ты, аналогичные таковым в тромбоцитах мыши без P2Y|: они не могут ни аг­ регировать, ни изменять форму. Однако Gq-дефицитные тромбоциты сохра­ няют способность изменять форму в ответ на воздействие других агонистов, показывающих, что Gq опосредует АДФ-зависимые структурные изменения актиновых филаментов, вследствие чего тромбоциты изменяют форму, а дру­ гие G-белки (вероятно Gn) опосредуют эти изменения в цитоскелете в ответ на действие других агонистов [115].

Gj-сопряженный рецептор АДФ — P2Y|2 необходим для активации реце­ птора фибриногена и формирования тромба. Он важен для необратимой аг­ регации тромбоцитов, вызываемой не только АДФ, но и тромбоксаном А2 и PAR-1-специфичным пептидом. P2Y|2 ингибирует аденилилциклазу, но не играет роли в изменении формы тромбоцитов и накоплении внутриклеточ­ ного кальция, происходящих под действием АДФ. Кроме того, Gj-сигна- линг, опосредованный активацией P2Y|2, может приводить к агрегации тром­ боцитов, когда Gqили G12/13-nyTH одновременно активированы, или в на­ личии высокая концентрация АДФ (100 мкМ).

P2Yi2 играет решающую роль в АДФ-опосредованной генерации тромбо­ ксана А2, а также ускоряет индуцированное агонистом высвобождение ком­ понентов плотных гранул и прокоагулянтную активность. От активации P2Y12 зависят высвобождение из а-гранул Р-селектина и следующая за этим его экспрессия. Интересно, что все функции упомянутого рецептора могут быть сходны с таковыми эпинефринов, которые активируют Gj-белки свя­ зыванием с а2А-тромбоцитарным рецептором [116].

P2Y12 играет главную роль в активации тромбоцитов, привлечении дру­ гих тромбоцитов к месту повреждения с последующей их адгезией к фактору фон Виллебранда и коллагену, а также в повышении эффективности актива­ ции тромбоцитов вторичными агонистами, такими, как тромбин и тромбо­ ксан А2 (см. вклейку, рис. 16).

P2Yi2 взаимодействует в основном с Gj2- и в меньшей степени с другими Gj-белками, что приводит к ингибированию аденилилциклазы. Так, тромбо­ циты мыши с недостатком функционального P2Y12 не могут нормально агре-

62

1.6. Тромбоциты и тромбин

гировать в ответ на действие АДФ. Они сохраняют связанный с P2YI ответ, включающий изменение формы и активацию фосфолипазы С, но теряют способность ингибировать образование цАМФ при участии аденилилциклазы. Эпинефрины посредством активации рецептора а2А и последующим Gz-сигналингом оказывают такой же эффект. Однако сниженный уровень цАМФ имеет косвенное отношение к активации P2Yi2. Gj-сигналинг приво­ дит к активации PI3K-, Akt-, Raplb- и К+-каналов. У мышей с недостатком РПЗу наблюдаются нарушения в функционировании тромбоцитов только при использовании низких концентраций АДФ, но эти же мыши обеспече­ ны защитой от тромбоэмболии [117]. Показано также, что Akt-, Raplb- и К+-каналы являются важными функциональными эффекторами активации P2Yi2 (см. вклейку, рис. 17).

1.6. ТРОМБОЦИТЫ И ТРОМБИН

Тромбин — сериновая протеиназа, активная форма про­ тромбина, который является основным проферментом системы свертыва­ ния крови и активируется в тромбин в процессе реакций коагуляционного каскада. В активации тромбоцитов тромбин играет такую же существенную роль, как и в формировании фибринового сгустка. In vitro тромбин вызывает изменение формы тромбоцитов, склеивает их друг с другом и способствует высвобождению компонентов гранул. Однако о механизме активации было известно очень мало. Большим шагом вперед в изучении активации тромбо­ цитов тромбином явилось обнаружение в 1990 г. G-белоксопряженных ре­ цепторов, которые активировались тромбином [118]. В результате многочис­ ленных исследований установлено, что активация G-белков тромбином происходит при их непосредственном связывании на участках поверхности тромбоцитов, содержащих GPl0a и GPV, однако расщепление последнего для активации тромбоцитов не требуется. В связи с этим выработаны краткие критерии соответствия белка как рецептора для тромбина: а) возможный ре­ цептор должен располагаться на поверхности покоящихся тромбоцитов; б) данный белок должен быть субстратом для тромбина; в) наличие связи с внутриклеточным сигнальным каскадом; г) экспрессия возможного рецеп­ тора в клетке, которая иначе реагирует на тромбин; д) уменьшение ответа тромбоцитов на действие тромбина вследствие блокирования или разруше­ ния возможного рецептора. Всем этим критериям полностью соответствуют протеиназактивированные рецепторы (ПАР).

Согласно последним данным, семейство ПАР включает четыре белка, три из которых (ПАР-1, ПАР-3 и ПАР-4) являются рецепторами тромбина, а четвертый — ПАР-2 активируется сериновой протеиназой, отличной от тро­ мбина. Все четыре рецептора имеют сходное строение, включая N-концевой участок (см. вклейку, рис. 18). На примере ПАР-1 показано, что и остальные три рецептора функционируют аналогично [119]. В любом случае активация рецептора начинается после расщепления его N-концевого участка тромби­ ном. При этом экспонируется новая N-концевая последовательность, кото­ рая служит связующим лигандом. Протеиназы, отличающиеся от тромбина,

63

ГЛ АВ А 1. Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз

также могут активировать ПАР-1, но в этих случаях ответ рецептора на тро­ мбин — другой, поскольку N-концевой участок расщепляется в “неправиль­ ном” месте. Центр связывания лиганда находится в экстрацеллюлярных петлях рецептора. В случае других G-белков взаимодействие между лиганда­ ми ПАР и рецептором инициирует сигналинг вследствие конформационных изменений в рецепторе, которое переносится через плазматическую мем­ брану и способствует обмену ГТФ на ГДФ на G-белках. В случае ПАР осо­ бенности активации, установленные для ПАР-1, включают способность ответа на пептиды, составляющие последовательность лиганда. Исключени­ ем из правил является ПАР-3, для которого активационный пептид не обна­ ружен [120]. Относительно трех других ПАР известно, что ПАР-2 экспресси­ рован многочисленными тканями, включая и эндотелий, но не тромбоциты. ПАР-2 расщепляется и активируется трипсином и трипгазой, но не тромби­ ном. Кроме того, данный рецептор может активироваться комплексом тка­ невый фактор + Vila и фактором Ха. ПАР-3 обнаружен в процессе исследо­ ваний, которые показали, что тромбоциты мыши, лишенные ПАР-1, спосо­ бны активироваться тромбином. ПАР-3 является основным регулятором ответа на тромбин тромбоцитов грызунов и человека. ПАР-3 тромбоцитов всего лишь способствует расщеплению тромбином ПАР-4. ПАР-4 находится в тромбоцитах мыши и человека и поддерживает способность тромбоцитов мыши, лишенных ПАР-3, активироваться тромбином. Для активации ПАР-4 необходима 10—100-кратная концентрация тромбина, поскольку в рецепторе отсутствует гирудинподобная последовательность, которая может взаимодействовать с анионсвязываюшим экзосайтом и способствовать рас­ щеплению рецептора тромбином [121]. Одновременное ингибирование ПАР-1 и ПАР-4 тромбоцитов человека антителами или антагонистами по­ лностью уничтожает способность тромбоцитов активироваться тромбином.

Активация тромбоцитов тромбином, с одной стороны, происходит вследствие расщепления и активации ПАР-1 и ПАР-4 (см. вклейку, рис. 19), с другой — эти рецепторы активируют некоторые G-белки, вызывают повы­ шение концентрации цитозольного кальция и ингибируют образование цАМФ. Этот процесс сопровождается высвобождением АДФ и тромбоксана А2, которые связываются с их собственными рецепторами на поверхности тромбоцитов. Для расщепления ПАР-4 тромбоцитов человека требуется бо­ лее высокая концентрация тромбина, чем для расщепления ПАР-1. Вероят­ но, ПАР-1 является преобладающим сигнальным рецептором при низкой концентрации тромбина, однако активация ПАР-4 может быть более устой­ чивой. Тромбоциты мыши — интересная противоположность тромбоцитам человека. Несмотря на то что в месте, где тромбоциты человека экспресси­ руют ПАР-1 и ПАР-4, тромбоциты мыши — экспрессируют ПАР-3 и ПАР-4, сигналинг обеспечивается непосредственно ПАР-4. Содействие ПАР-3 в этом случае только способствует расщеплению ПАР-4 при низкой концент­ рации тромбина [122].

Обсуждая активацию тромбоцитов тромбином, следует учитывать вклад и других рецепторов, в частности компонентов комплекса GPIb-IX-V. GPlb представляет собой гетеродимер, состоящий из а- и р-субъединиц,

64

ГЛАВА 1. Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз

ние тромбинсвязывающего центра снижает ответ тромбоцитов на тромбин. Теоретически связывание тромбина с GPIba может способствовать рас­ щеплению ПАР на тромбоцитах человека. Сильное связывание тромбина с ПАР-3 способствует расщеплению ПАР-4 на тромбоцитах мышей (рис. 1.11). Несмотря на то что первичный ответ тромбоцитов человека на тром­ бин определяется ПАР-1 и ПАР-4, вполне возможно, что взаимодействия одного и более компонентов комплекса GPlb-lX-V могут способствовать расщеплению/активации ПАР-1 или по-другому регулировать активацию тромбоцитов тромбином [123].

1.7. ИНТЕГРИНЫ

Интегрины — семейство белков, находящихся на поверх­ ности клетки, которые обеспечивают клеточную адгезию. Процесс адгезии для клеток чрезвычайно важен, поскольку отвечает за закрепление клеток после миграции и передачу сигналов для роста и дифференциации. Сущест­ вуют два основных типа клеточной адгезии: клетка-внеклеточный матрикс

(/) и клетка-клетка (2). Интегрины являются первичными посредниками адгезии первого типа, а также выступают в роли активных молекул в адгезии второго типа. Открытие интегринов явилось значительным шагом вперед в понимании процесса адгезии. Семейство этих рецепторов было обнаружено в середине 1980-х годов. В результате многочисленных исследований было показано, во-первых, что группа адгезивных белков цыплят, тромбоцита­ рный интегрин GPIIbllla, адгезивные белки лимфоцитов, антигены кле­ точной поверхности VLA, а также рецепторы фибронектина и витронек­ тина обладают сходными структурой и активностью. Во-вторых, работе по изучению интегринов предшествовали годы детальных исследований белков внеклеточного матрикса, для которых интегрины являются реце­ пторами. В-третьих, стало очевидным, что интегрины важны для испо­ льзования во многих областях биологии и медицины. Название интегри­ ны эта группа белков получила в связи с их ролью в объединении (интегра­ ции) внутриклеточного цитоскелета с внеклеточным матриксом. Обнаружи­ ваются интегрины практически во всех клетках. Кроме адгезии и агрегации они участвуют как в дифференциации тканей, так и в росте раковых клеток и метастазировании. Интегрины вносят свой вклад в адгезию и миграцию лей­ коцитов, а также контролируют адгезию лимфоцитов (хоминг) в лимфатичес­ ких тканях [124, 125].

Для адгезии, распластывания и передвижения клеток интегрины долж­ ны связывать появляющиеся элементы цитоскелета с элементами внекле­ точного матрикса. Это взаимодействие состоит из двух частей: связь инте- грин-цитоскелет и связь интегрин-лиганд. Регуляция связывания инте- грин-лиганд осуществляется контролированием конформации интегрина, который может находиться в неактивном, с низкоаффинной конформацией, и активном, с высокоаффинной конформацией, состояниях. Для состояния гемостаза такая регуляция имеет большое фукциональное значение. На­ пример, в случае тромбастении Гланцмана гемостаз нарушен, поскольку ин-

66

1.7. Интегрины

тегрин GPHbllla неактивен. Неактивированные интегрины слабо опосреду­ ют адгезию и распластывание клеток по сравнению с высокоаффинными интегринами. Нарушение силы взаимодействия интегрин-лиганд вследст­ вие мутаций может оказывать влияние на подвижность клеток [126—128].

Возникает вопрос, влияет ли активация интегринов на связывание лига­ ндов или на взаимодействие интегрин-цитоскелет. В пределах внутренних фокусных контактов взаимодействие интегрин-цитоскелет регулируется. Меньше известно о регуляции взаимодействия интегрин-цитоскелет в пре­ делах внешних контактов, которые являются более слабыми и временными, но важны для инициации клеточной адгезии и подвижности. Вполне понят­ но, что молекулярная основа таких взаимодействий сильно отличается от та­ ковой фокусного контакта, поскольку белковые комплексы малы.

Интегрины — мембранные гликопротеины, представляющие собой нековалентно связанные гетеродимеры, состоящие из двух типов субъеди­ ниц -аир. У млекопитающих 18 а и 8 р нековалентно связанных субъе­ диниц образуют 24 интегрина. Основная масса а- и р-субъединиц длиной порядка 1000 и 750 аминокислотных остатков соответственно является экст­ рацеллюлярной. Каждая субъединица представляет мембранный глико­ протеин I типа с коротким цитоплазматическим “хвостом” (~20 и ~50 ами­ нокислотных остатков соответственно для а- и р-субъединиц; исключением является р4, содержащая 1072 аминокислотных остатка “хвоста”, который связывает промежуточные филаменты). Половина а-субъединиц интегри­ нов возле своих N-концевых участков содержит -180 дополнительных ами­ нокислот А-домена фактора фон Виллебранда (эти интегрины известны как аА и а1). Структура аА предполагает нуклеотидсвязывающую а/p укладку — структуру, подвергающуюся частичным изменениям и обнаруженную в неко­ торых белках, включая конформационно активные G-белки. Девять аА-со- держащих интегринов “узнают” в лигандах глутаматсодержащий мотив по­ следовательности быстрее, чем аспартатсодержащий, но обнаруживают та­ кие же особенности двунаправленной активации и сигналинга, как и интег­ рины без аА [129].

Интегрины классифицируются на основе p-цепи, которая вместе со специфической a-цепью образует функциональный рецептор. Как а-, так и p-цепи интегринов содержат крупные N-концевые экстрацеллюлярные до­ мены, небольшой трансмембранный участок и С-концевой участок. р-Субъ- единица охватывает четыре цистеинбогатые последовательности, которые в разной форме сохраняются во всех восьми субъединицах. Цитоплазматичес­ кий участок p-цепи удерживает интегрин в цитоскелете и регулирует его фу­ нкции. а-Субъединица содержит три—четыре участка связывания с двухва­ лентными катионами.

Структура и взаимодействия интегринов схематически представлены на рис. 1.12. Центр связывания интегринов с лигандами сформирован последо­ вательностью обеих субъединиц, а их цитоплазматические домены обеспе­ чивают связь с цитоскелетом, в результате чего сами интегрины являются связующим звеном между цитоскелетом и внеклеточным матриксом.

1.7. Интегрины

Таблица 1.1. Семейство интегринов

Примечание. Coll — коллаген; Fg — фибриноген; Fn — фибронектин; Ln — ламинин; Vn — ви­ тронектин; TSP — тромбоспондин; VLA — very late antigen; VNR — рецептор витронектина; vWF — фактор фон Виллебранда; FX — фактор X. Темным шрифтом отмечены случаи, касающиеся тромбо­ цитов.

рый экспрессирован только тромбоцитами и мегакариоцитами, LFA-1, Мас-1 и pl 50/95, находящиеся на мембране лейкоцитов. Интегрин а6р4 спе­ цифичен для эпителиальных клеток и образованных ими опухолей [130].

Многие интегрины связываются с внеклеточным матриксом и вследст­ вие этого опосредуют взаимодействие клетка-внеклеточный матрикс. К интегриновым лигандам внеклеточного матрикса относятся гликопротеины, такие, как фибронектин, фибриноген, ламинин, коллаген, тромбоспондин, фактор фон Виллебранда, витронектин. Кроме внеклеточного матрикса эти белки в растворимой форме находятся в плазме крови. Некоторые интегри­ ны связывают с клеточной мембраной белки, участвующие в адгезии клет-

69