Волков Г. Л. Современные представления о системе гемостаза

ГЛ АВ А 2. Молекулярные основы свертывания крови

1 %), а у гетерозигот выявляется от 20 до 60 % активности этого фактора. Приобретенная недостаточность фактора XII наблюдается при воспалитель­ ных процессах инфекционной природы. Выдвинута гипотеза, согласно ко­ торой снижение активности фактора XII является следствием подавления его синтеза под действием интерлейкина-6.

Субстраты фактора ХПа в плазме крови — прекаликреин, факторы XI, VII, плазминоген [49, 50]. Фактор XII синтезируется гепатоцитами.

Фактор XI — гликопротеин, циркулирующий в крови в концентрации 30 нМ. Активированная форма фактора Х1а (КФ 3.4.21.27) участвует не в инициации, а в поддержании процесса свертывания крови. Профермент циркулирует в крови в комплексе с высокомолекулярным кининогеном.

По химической природе фактор XI представляет собой гомодимер, со­ стоящий из двух полипептидных цепей молекулярной массой 160 кДа, сос­ тоящих из 608 аминокислотных остатков. Углеводы составляют около 5 % массы молекулы. Цепи соединены одной дисульфидной связью и содержат 35 остатков полуцистина, которые вовлечены в образование дисульфидных связей. Выявлено пять участков потенциального гликозилирования (рис. 2.1).

В N-концевой части молекулы фактора XI расположены четыре повто­ ряющихся так называемых яблоковидных домена (Al—А4) и каталитичес­ кий домен (С). Каждый А домен состоит из 90—91 аминокислотного остат­ ка, гомологичных таковым в прекалликреине. Домен С содержит 238 амино­ кислотных остатков. Каталитическая триада домена С состоит из His4l3, Ser557, Asp55i [2, 18, 51].

Активация фактора XI происходит при участии тромбина и комплекса, состоящего из фактора ХПа, калликреина и высокомолекулярного кининогена [46, 51]. В процессе активации фактора XI происходит расщепление пе­ птидной связи Arg369—Ser370 в каждой полипептидной цепи гомодимера с образованием активного фермента. Фактор Х1а состоит из двух идентичных субъединиц, состоящих из тяжелой (молекулярная масса 50 кДа) и легкой (молекулярная масса 30 кДа) полипептидных цепей. Субъединицы соедине­ ны одной дисульфидной связью, а тяжелая и легкая цепи — тремя. В отли­ чие от других факторов системы свертывания крови фактор Х1а содержит два активных центра. Подобно другим факторам систем свертывания крови и фибринолиза тяжелая цепь фактора выполняет регуляторную роль в про­ явлении ферментативной активности, определяет субстратную специфич­ ность и влияет на каталитическую эффективность фактора Х1а при взаимо­ действии с субстратом, фактором IX и кофактором — ВМК.

Функция фактора Х1а заключается в активации фактора IX путем огра­ ниченного протеолиза. Врожденная недостаточность фактора XI (гемофи­ лия С) — редкое заболевание (до 7 % случаев больных гемофилией). В отли­ чие от гемофилии А и В наследование носит аутосомно-рецессивный харак­ тер. Клиническое проявление значительно слабее по сравнению с другими формами гемофилии. Заболевание обычно проявляется в виде посттравма­ тических и постоперационных кровотечений [52]. У гетерозигот риск пост­ операционных кровотечений обнаруживается редко [2, 18].

102

2.1. Компоненты системы свертывания крови

2.1.3. Белковые кофакторы

Фактор V— гликопротеин молекулярной массой 330 кДа, циркулирующий в крови в концентрации 20 нМ (в крови находится до 75 % фактора V, в тромбоцитах — 18—25 %). Молекула имеет асимметричную па­ лочкообразную форму (соотношение осей 25:1) и состоит из одной полипептидной цепи из доменов А1-А2-В-АЗ-С1-С2 (рис. 2.6). 14 остатков цистеина образуют внутримолекулярные дисульфидные связи, а четыре — содержат свободные сульфгидрильные группы. Обнаружено две формы фактора V, которые различаются по степени гликозилирования С-концевого домена С2, что определяет их сродство к фосфолипидам мембраны тромбоцитов [1, 2, 18].

Активация фактора V происходит при расщеплении тромбином трех пептидних связей: Arg709—Ser7,0, Arg1()18—Thr1019, Arg1545—Ser,546, что сопрово­ ждается образованием гетеродимера, состоящего из двух цепей (тяжелой — 105 кДа и легкой — 74 кДа) [53, 54]. Обе субъединицы нековалентно связаны ионами кальция. Тяжелая цепь содержит N-концевой участок прокофактора и образует два А-домена (аминокислотные остатки 1—303 и 317—656). С-кон- цевой участок молекулы фактора V образует один A-домен (аминокислот­ ные остатки 1546—1877) и два С-домена (аминокислотные остатки 1878—2036 и 2037—2196). Наиболее крупный гликозилированный домен В (аминокислотные остатки 710—1545) для проявления кофакторной актив­ ности фактора Va не требуется и отделяется при активации. Из яда гадюки Рассела выделен фермент-активатор фактора V, который, в отличие от тром­ бина, расщепляет связи Arg|545—Ser1546 и Arg10|8—Ser1O2o, что приводит к об­ разованию тяжелой цепи молекулярной массой 230 кДа, содержащей доме­ ны Al, А2 и В. Это свидетельствует о том, что для проявления гемокоагули­ рующего действия фактора Va отделение домена В не обязательно. Фактор V может также активироваться фактором Ха, но при этом расщепляются связи Arg709-Ser710 и Arg1018-Serl0|9.

В молекуле сульфированы остатки тирозина 665, 696, 698, 1494, 1510, 1515, 1565. Установлено, что сульфирование фактора V важно для процесса активации прокофактора тромбином и взаимодействие фактора Va с компо­ нентами протромбиназного комплекса.

Фактор Va неспособен активировать протромбин, но в процессе сверты­ вания крови он выполняет существенную кофакторную роль при активации протромбина под действием фактора Ха.

Фактор VIII (антигемофильный фактор А) — гликопротеин молекуляр­ ной массой 330 кДа, циркулирующий в крови человека в концентрации 0,7 нМ в виде нековалентного комплекса с фактором фон Виллебранда. Пе­ риод полужизни фактора VIII, находящегося в комплексе, составляет 7—12 ч. Фактор фон Виллебранда выполняет роль белкового носителя, предохраня­ ющего фактор VIII in vivo от протеолитической деградации.

Молекулы фактора VIII представляют собой варьирующие по длине тя­ желые цепи, образующие А1-А2-В-домена, нековалентно связанные с лег­ кими полипептидными цепями, состоящими из АЗ-С1-С2-доменов. Пред­ полагается, что в объединении этих полипептидных цепей участвуют двухва-

103

2.1. Компоненты системы свертывания крови

ков фактора VIII дифференциально влияет на кофакторную и функциональ­ ную активность фактора Villa.

Активация фактора VIII под действием тромбина осуществляется в две стадии: на первой происходит расщепление пептидных связей Arg74() и Argl689, что сопровождается пятикратным увеличением кофакторной актив­ ности, на второй — полная активация фактора VIII обеспечивается расщеп­ лением пептидной связи Arg372. Расщепление пептидной связи Arg,689 на пер­ вой стадии активации приводит к высвобождению из комплекса фактора фон Виллебранда. Фактор Villa состоит из фрагментов молекулярной мас­ сой 50 (А1-домен), 40 (А2-домен) и 74 кДа (АЗС1С2-домен). Эти три субъ­ единицы нековалентно связаны двухвалентными ионами металлов.

Вместе с фосфолипидами и ионами кальция фактор VIII выполняет ко­ факторную функцию при активации фактора X под действием фактора 1Ха. Он присутствует в плазме крови в форме нековалентного комплекса с фак­ тором фон Виллебранда, его коагуляционная функция состоит в ускорении преобразования фактора X в активную форму под действием фактора 1Ха. При снижении содержания или отсутствии факторов VIII и IX наблюдаются гемофилический синдром, классические гемофилии А и гемофилии В, кото­ рые характеризуются геморрагическим состоянием [1, 2, 18, 55—57].

Фактор фон Виллебранда принадлежит к семейству адгезивных белков и представляет собой гетерогенную популяцию гликопротеиновых мультиме­ ров, регулирующих прилипание тромбоцитов к поврежденным тканям сосу­ дов. Наряду с этим фактор фон Виллебранда действует как белок-носитель, защищающий фактор VIII от протеолиза in vivo. Он присутствует в плазме крови, тромбоцитах и субэндотелии.

Концентрация фактора фон Виллебранда в крови составляет 7 мкг/мл. Фактор фон Виллебранда синтезируется в виде предшественника молекуляр­ ной массой 275 кДа, который состоит из сигнального пептида, пропептида и структурной субъединицы. Предшественник димеризуется в эндоплазматиче­ ском ретикулуме за счет образования дисульфидных связей в С-концевой ча­ сти структурной субъединицы. Там же происходит N-гликозилирование. За­ тем посредством образования второго набора межцепочечных дисульфидных мостиков происходит мультимеризация. Наиболее крупные мультимеры хра­ нятся в специфических для большинства эндотелиальных клеток удлиненных органеллах, называемых тельцами Вейбеля-Паладе. В местах повреждения сосуда или воспаления такие физиологические агенты, как тромбин, фибрин или гистамин, могут вызвать выделение этих крупных биологически актив­ ных мультимеров фактора фон Виллебранда из телец Вейбеля-Паладе в кровь или субэндотелий. Гомоцистеин нарушает процессинг и секрецию путем по­ давления транспорта из эндоплазматического ретикулума [58].

Первый домен N-концевого участка зрелой молекулы фактора фон Вил­ лебранда, состоящий из 272 аминокислотных остатков, стабилизирует фак­ тор VIII, связываясь с его легкой цепью. Каждая субъединица мультимерного фактора фон Виллебранда может присоединить гетеродимерную молекулу фактора VIII, однако in vivo большинство мест связывания остается свобод­ ным, поскольку молярная концентрация последнего значительно меньше. Насыщение составляет 1—8 %.

105

ГЛ АВ А 2. Молекулярные основы свертывания крови

Исследование аминокислотной последовательности трех цепей фибри­ ногена прямым секвенированием полипептидных цепей показало, что Act, Вр~ и у-цепи фибриногена человека содержат 610, 461 и 411 аминокислот­ ных остатков. Последовательность аминокислот в цепях фибриногена была также определена по расшифрованной структуре кДНК, кодирующей отде­ льные цепи. Результаты обоих исследований совпадают. Сравнение амино­ кислотной последовательности трех полипептидных цепей фибриногена по­ казало высокую степень гомологии, что позволило предположить их образо­ вание от общего предшественника путем дупликации генов. Степень гомо­ логии между Вр- и у-цепями фибриногена человека составляет 30 %, в то время как Аа-цепь гомологична у- или Bp-цепи на 10 %, имея более высо­ кие степени гомологии на отдельных участках [59—61].

Углеводная часть молекулы фибриногена составляет около 3,5 % общей ее массы. Известно, что в каждой субъединице фибриногена человека гли­ козилированы Asn364 Bp-цепи и Asn52 у-цепи. Показано, что углеводы явля­ ются олигосахаридами с концевыми сиаловыми кислотами.

Субъединицы фибриногена соединяются дисульфидными связями меж­ ду симметричными аминокислотными остатками Аа Cys28, у Cys8 и у Cys9 в N-концевых участках Аа-, у-цепей и 2(Аа Cys36—Bp Cys65). Дисульфидные связи соединяют N-концевые участки у-цепей в антипараллельной ориента­ ции. Показано, что дисульфидные связи между субъединицами имеют высо­ кую стабильность и не принимают участия в реакциях дисульфидного обме­ на [62, 63]. Все цистеиновые остатки в молекуле фибриногена принимают участие в создании 29 дисульфидных связей. В каждой субъединице шесть дисульфидных связей образуют два дисульфидных кольца К.1 и К2, располо­ женных на расстоянии 111 аминокислотных остатков в Аа- и Bp-цепях и 112 аминокислотных остатков — в у-цепи. Участки полипептидных цепей между дисульфидными кольцами имеют суперспиральную структуру, что способ­ ствует поддержанию жесткой конформации, являющейся уникальной осо­ бенностью молекулы фибриногена [62, 64]. Между дисульфидными кольца­ ми расположен лабильный участок (Аа 96—119; Вр 127—150 и у 70—93), ко­ торый не имеет вторичной структуры и содержит связи, доступные фермен­ тативному расщеплению.

Физико-химические свойства и пространственная организация молеку­ лы фибриногена обусловлены его структурными особенностями. Изоэлект­ рическая точка белка находится в зоне pH 5,5. Тепловая денатурация фибри­ ногена при нейтральном pH происходит при температуре 50—53 °C. Смеще­ ние pH среды в кислую или щелочную зону снижает температуру денатура­ ции [65].

Для определения пространственного строения молекулы фибриногена использован целый ряд современных физико-химических методов: гидроди­ намические исследования, спектрофотометрия, сканирующая микрокало­ риметрия, круговой дихроизм, компьютерное моделирование вторичной структуры. Эти подходы дали возможность получить информацию о размере и форме молекулы в растворе при условиях, близких к физиологическим. Исследование растворов фибриногена методом малоуглового рассеяния

108

2.1. Компоненты системы свертывания крови

нейтронов показало, что молекулы фибриногена имеют бананообразную форму с аксиальным соотношением р = а/Ь = 3,1 (а = 140 А; b = 45 А), объем гидратированной молекулы (3,7 ■ 105 А3). Эти данные совпадают с гидро­ динамическими параметрами фибриногена. Значительная вязкость раст­ воров фибриногена может быть связана с высокой гидратацией молекулы или с сильной асимметрией молекулы, что подтверждено методом элект­ ронной микроскопии с использованием метода замораживания—скалыва­ ния [66, 67].

Для выяснения доменной организации молекулы фибриногена оказа­ лось плодотворным использование методов электронной микроскопии, ограниченного протеолиза и сканирующей микрокалориметрии. Эти при­ емы позволили целенаправленно выделять фрагменты фибриногена, сохра­ няющие нативную конформацию, для изучения их пространственной струк­ турной организации. Использование такого подхода дало возможность уста­ новить, что С-концевой D-домен состоит из пяти субдоменов, а централь­ ный Е-домен — из двух идентичных субдоменов (рис. 2.8). Показано также, что С-концевые фрагменты Аа-цепей 240—610, которые предварительно рас­ сматривались как неупорядоченные полипептидные цепи, имеют упорядо­ ченную доменную область — аС-домен (368—585) и неупорядоченную — участок цепи 238—338 — коннектор; аС-домены в молекуле фибриногена взаимодействуют между собой и нековалентно соединяются с Е-доменом [68-73].

Установлено, что фибриноген имеет три центра связывания Са2+ высо­ кой аффинности (KD • 10_6) и несколько центров слабого связывания Са2+ (KD • 10-3) [74, 75].

Одной из основных функций фибриногена является его способность под действием тромбина превращаться в мономерный фибрин, который за­ тем спонтанно полимеризуется и создает волокнистую сеть фибрина, служа­ щую основой сгустка, предупреждающего кровопотерю.

Самосборка фибрина — строго упорядоченный процесс, отдельные эта­ пы которого регламентированы каталитической активностью тромбина, обеспечивающего экспонирование центров полимеризации и образование определенных форм фибрина (фибрин дез-АА, протофибриллы, фибрин дез-ААВВ). Функциональные свойства каждой формы фибрина обусловле­ ны последовательным включением новых доменов молекулы фибрина в по­ строение фибринового сгустка (см. рис. 2.8).

Процесс самосборки фибрина разделяют на несколько этапов. На пер­ вом фибриноген превращается в фибрин-мономер, на втором — его молеку­ лы спонтанно полимеризуются с образованием двунитчатых структур — протофибрилл, на третьем — протофибриллы путем латеральной ассоциа­ ции соединяются в фибриллы, которые и составляют трехмерную сетку [76-78].

Превращение фибриногена в мономерный фибрин происходит в ре­ зультате ограниченного протеолитического действия тромбина, который от­ щепляет от NH2-KOHueBbix участков Аа- и Bp-цепей фибриногена соответст­ венно фибринопептиды А (16 аминокислотных остатков) и В (14 аминокис-

109