Анализ подвижности флуоресцентных макромолекул (30 Кд, 90 Кд, 150 Кд) в интерфазном и метафазном хроматине с помощью флуоресцентной коррелятивной спектроскопии
В метафазных хромосомах концентрация нуклеосомных частиц в 5-10 раз выше, чем в интерфазном хроматине.
Тем не менее, коэффиценты диффузии флуоресцентных макромолекул различаются не существенно (на 30-50%)
Флуктуация интенсивности сигнала отражает тот факт, что флуоресцентные белки могут входить в зону наблюдения и выходить из нее
компъютерное моделирование показывает , что пентамер EGFP может двигаться практически свободно в интерфазном хроматине и вообще не должен двигаться в
метафазных хромосома, если позиции нуклеосом фиксированы. Если нуклеосомам разрешено двигаться на 10-нм, то даже в метафазных хромосомах устраняются препятствия для перемещения пентамера EGFP, размеры которого сопоставимы с размерами нуклеосомы
анализ подвижности в интерфазном и метафазном хроматине индивидуальных нуклеосом, меченных фотоактивируемым EGFP, слитым с гистоном Н4,
спонтанная активация флуоресценции, которая происходит очень редко, позволяет следить за индивидуальными нуклеосомами
случайное перемещение нуклеосом (флуктуации) происходит со скоростью (~50 nm per 30 ms)
как в интерфазном, так и в метафазном хроматине
результаты соответствуют модели нерегулярной упаковки хроматина в структуры типа расплавленной глобулы
Как выделить транскрипционно-активную фракцию хроматина?
Выделение коротких фрагментов хроматина, солюбилизирующихся при коротком нуклеазном переваре
Фракционирование на ртутной колонке (Allfrey)
Ацетилирование гистонов не только препятствует компактной упаковке нуклеосомной нити, но и приводит и пространственной реорганизации самих нуклеосом.
Считается, что такая реорганизация облегчает транскрипцию организованной в нуклеосомы ДНК
HAT
HDAC
Bazett-Jones DP, Mendez E, Czarnota GJ, Ottensmeyer FP, Allfrey VG.
Nucleic Acids Res. 1996 Jan 15;24(2):321-9.
Нуклеосомы не связавшиеся |
Нуклеосомы, связавшиеся с ртутной |
с иммобилизированными на носителе |
колонкой |
ионами ртути |
|