Лекция №3. Гаметогенез и оплодотворение.

Морфофункциональная характеристика половых клеток. Сперматогенез и овогенез. Сравнительная характеристика.

Половыми клетками являются мужская половая клетка сперматозоид и женская половая клетка - яйцеклетка. Половые клетки гаплоидны.

СПЕРМАТОЗОИД. Состоит из головки и хвостика и имеет длину 60-70 мкм. В свою очередь, в хвостике различают связующий, промежуточный, главный и дистальный отделы.

На обычных гистологических препаратах ядра сперматозоидов обладают резко выраженной базофилий, и имеет вытянутую грушевидную форму. Ядро характеризуется плотным расположением хроматина, в котором наряду с гистоновыми находятся также простые негистоновые белки, обладающие положительным зарядом. ДНК в хроматине упакована параллельно, поэтому ядро имеет кристаллоподобную структуру, его объем сведен до минимума. Ядро сперматозоида гаплоидно, содержит 22 аутосомы и 1 половую хромосому, которая может быть либо Х-, либо Y- хромосомой. Количество сперматозоидов с Х- или Y-хромосомой примерно одинаковое. Ядерная оболочка сперматозоидов полностью лишена ядерных пор.

В передней части ядра под цитолеммой сперматозоида находится акросома - производное комплекса Гольджи и аналог лизосомы. Ее мембрана спереди прилежит к цитолемме, а сзади - к ядерной мембране. В акросоме содержатся ферменты (10-12 различных ферментов), расщепляющие компоненты прозрачной оболочки яйцеклетки: гиалуронидазы, протеазы, гликозидазы, липазы, нейраминядазу и фосфатазы и др.

Цитоплазма сперматозоида редуцирована до минимума и очень тонким слоем покрывает ядро.

Связующий отдел хвостика содержит проксимальную центриоль, которая прилежит к ядру, располагаясь в углублении ядерной оболочки. Здесь же находится дистальная центриоль. От нее отходит осевая нить - аксонема, имеющая структуру реснички и состоящая из 9 периферических дуплетов микротрубочек и двух расположенных в центре одиночных микротрубочек. Аксонема продолжается во все отделы хвостика, редуцируясь в остальном отделе. Снаружи напротив каждого дуплета дистальной центриоли в связующем отделе находится одна так называемая сегментированная колонна (всего их число Равно 9).

В промежуточном отделе хвостика сегментированные колонны продолжаются в 9 плотных волокон. В этом же отделе вокруг аксонеммы и плотных волокон в виде спирали располагаются митохондрии. В главной части хвостика два из девяти плотных волокон, расположенные напротив друг друга, резко утолщаются и превращаются в про­дольные столбы, которые соединяются между собой боковыми ребрами. Формируется внешняя волокнистая оболочка, придающая жесткость и упругость хвостику. Таким образом, сегментированные колонны, плотные волокна, продольные столбы и соединяющие их ребра, а также внешняя волокнистая оболочка образуют каркас хвостика. В дистальном отделе количество микротрубочек сильно редуцируется. Снаружи хвостик покрыт цитолеммой. Благодаря движению хвостика сперматозоиды могут двигаться со скоростью 1 -5 мм в минуту.

ЯЙЦЕКЛЕТКА. Это женская половая клетка с гаплоидным набором хромосом. В процессе овуляции из яичника выходит овоцит второго порядка с незавершенным мейозом, заблокированным на метафазе 2 мейотического деления. Этот блок хромосомного апланата овулировавших овоцитов 2 порядка достаточно стабильный, так что клетки могут длительно сохраняться в метафазе II мейоза. Блокада мейоза снимается лишь при оплодотворении, и завершение мейоза с образованием зрелой яйцеклетки происходит сразу после него.

Яйцеклетка (овоцит 2 порядка) человека имеет округлую форму. Ее диаметр равен около 130 мкм. Содержит 23 хромосомы, одна из которых половая Х-хромосома. При электронномикроскопическом исследовании в цитоплазме яйцеклетки выделяются митохондрии, комплекс Гольджи, хорошо развитые гранулярная и агранулярная эндоплазматическая. Снаружи яйцеклетка окружена плазматической мембраной. Под ней располагается толстый слой цитоплазмы толщиной 2-3 мкм. Вместе с цитолеммой его называют кортикальным слоем. В кортикальном слое находятся кортикальные гранулы содержащие различные ферменты, в том числе и овопероксидазу, действие которой на блестящую оболочку после оплодотворения резко изменяет свойства последней. Кортикальной слой играет важную роль в организации яйцеклетки, а также в оплодотворении.

Яйцеклетки имеют хорошо развитый и своеобразно организованный цитоскелет. Его компоненты связаны с цитолеммой и вызывают постоянную модификацию поверхности клетки, в которой могут появляться и исчезать микроворсинки, меняться локализация рецепторов. Яйцеклетки окружены блестящей оболочкой и слоем фолликулярных клеток. Между блестящей зоной и цитолеммой овоцита имеется небольшое перивителлиновое пространство, которое существенно увеличивается после оплодотворения, поскольку в него выделяются содержимое кортикальных гранул. Фолликулярные клетки через отверстия в блестящей оболочке посылают к цитолемме овоцита свои отростки.

В ряду позвоночных в зависимости от наличия желтка, его количества и распределения по ооплазме различают алицетальные (без желтка) и лецитальные (с желтком) яйцеклетки.

Лецитальные клетки делятся на олиголецитальные (маложелтковые) и полилецитальные (многожелтковые).

В зависимости от распределения желтка по ооплазме яйцеклетки делятся на изолоцитальные, умеренно телолецитальные и резко телолецитальные.

В изолецитальных яйцеклетках желток распределен равномерно. В умеренно телолецитальных яйцеклетках желток находится на одном полюсе, который называется вегетативным. На другом полюсе - анимальном - лежат органеллы и ядро. В резко телолгцитальных клетках вегетативный полюс выражен особенно сильно и занимает большую часть клетки.

Яйцеклетки млекопитающих, в том числе и человека, являются олигогаолецитальными: содержат очень мало желтка, который равномерно распределен по ооплазме.

Роль ядра и цитоплазмы в передаче наследственной информации.

Наследственная информация хранится в ядре половых клеток, в хромосомах. Она закодирована в триплетах ДНК - генах. Ядро выполняет две основные функции:

1. Хранение и передача наследственной информации.

2. Реализация наследственной информации.

Первая функция обеспечивается путем репликации молекул ДНК. Это позволяет при митозе двум дочерним клеткам получать одинаковые объемы генетической информации. Для сохранения генетической информации в неизмененном виде в ядре есть ферменты, которые ликвидируют повреждения молекул ДНК.

Вторая функция обеспечивается процессами транскрипции на молекулах ДНК различных информационных, транспортных и рибосоманых РНК. В ядре происходит также образование субъединиц рибосом путем соединения синтезированных в ядрышке рибосомных РНК с рибосомными белками. Эти белки синтезируются в цитоплазме и переносятся в ядро. Субъединицы рибосом выходят в цитоплазму и соединяются с информационной РНК. После этого происходит синтез белков, необходимых для дифференцировки и специализации, а также выполнения клетками функций. Кроме ядра, некоторое количество ДНК содержится в цитоплазме в митохондриях, которые могут самостоятельно синтезировать определенные белки для собственных нужд. В цитоплазме вырабатываются вещества (триггерные белки), способные проникать в ядро и регулировать активность генома клеток. Таким образом, цитоплазма и ядро тесно взаимосвязаны в выполнении функций по хранению и передаче наследственной информации.

Таким образом, программа эмбрионального развития индивидуума заключена в ДНК зиготы и реализуется на основе экспрессии репрессии генов, дифференцировки клеток под влияние эпигеномных стимулов и стимулов микроокружения

ПРОГЕНЕЗ. Прогенезом называется процесс образования половых клеток, или гаметогенез. Гаметогенез делится на сперматогенез (образование сперматозоидов) и овогенез (образование яйцеклеток). Развитие половых клеток в эмбриогенезе человека начинается довольно рано. Они возникают во внезародышевой желточной энтодерме в конце 3-й недели эмбриогенеза. Позднее эти клетки (они называются гонобласты) мигрируют в закладку половых желез на медиальной поверхности первичной почки и принимают участие в образовании половых желез - гонад.

Особенности сперматогенеза

Мужские половые клетки, как и женские, возникают из первичных гоноцитов. При сперматогенезе непосредственными потомками гоноцитов являются стволовые сперматогенные клетки (у млекопитающих называемые также сперматогониями типа А). Они присутствуют не только у зародышей, но и у половозрелых самцов; в семенниках млекопитающих они располагаются в пристеночном слое семенных канальцев. Стволовые клетки время от времени (нерегулярно) делятся, оставаясь в недифференцированном состоянии. Некоторые из них при этом перемещаются ближе к центру семенного канальца, их деления становятся более регулярными, а после каждого деления эти клетки изменяют свою величину и форму. Такие клетки называют либо просто сперматогониями, либо сперматогониями типа В, а их деления — сперматогониальными.

Сперматогониальные деления постоянно происходят у половозрелых самцов. Однако число делений отдельного сперматогония невелико (от 1 до 14) и строго определенно для каждого вида животного. Например, у паразитического червя Dicyema каждый сперматогоний делится всего один раз, у человека, по-видимому, 4 раза, а у рыбки гуппи —14 раз. Откуда же в таком случае берется столь значительное количество продуцируемых сперматозоидов (до 10⁸ в сутки у человека и кролика, 10¹⁰ у хряка и лошади и т. д.)? Очевидно, что в основном за счет делений стволовых клеток. И действительно, подсчитано, что у дрозофилы каждая стволовая сперматогониальная клетка (а всего этих клеток порядка 2⁸) делится 107 раз, т. е. продуцирует 2¹⁰⁷ сперматогониев, каждый из которых затем делится еще всего 4 раза.

После определенного числа делений сперматогоний передвигается еще ближе к просвету канальца, вступает в профазу 1-го деления созревания и начинает называться сперматоцитом I порядка. В результате 1-го деления созревания сперматоцит I порядка делится на два одинаковых сперматоцита II порядка, а последние в ходе 2-го деления созревания — на две сперматиды, обладающие, как и зрелая яйцеклетка, гаплоидным числом хромосом и количеством ДНК, соответствующим 1С. Затем каждая сперматида в результате сложных цитологических преобразований, не сопровождающихся клеточными делениями, преобразуется в сперматозоид. Этот процесс спермиогенеза продолжается несколько дней (4 дня у морского ежа, 23 дня у человека). Более подробно он рассматривается ниже.

Как сперматогоний, так и сперматоциты и сперматиды всех исследованных видов животных почти непрерывно связаны между собой цитоплазматическими мостиками, образуя синцитии. Этим, по-видимому, объясняется высокая степень синхронности делений сперматогониев и сперматоцитов в данном отделе семенного канальца. Деления эти идут последовательными циклами с периодом в несколько дней, а вдоль семенного канальца наблюдается волна сперматогониальных делений и вхождения в спермиогенез.

Важное значение для сперматогенеза имеют соматические клетки, расположенные в стенках семенных канальцев,— так называемые клетки Сертоли. К ним прикрепляются сперматиды и уже сформированные молодые сперматозоиды. По-видимому, клетки Сертоли снабжают сперматогониальные клетки питательными веществами и гормонами, способствуют высвобождению уже сформированных сперматозоидов в просвет канальцев, а также фагоцитируют неполноценные сперматозоиды.

Основные процессы, протекающие в ходе спермиогенеза (преобразования сперматиды в сперматозоид), таковы:

1. ядро сперматиды сильно уплотняется, хроматин конденсируется и становится синтетически совершенно инертным:

2. происходят перемещения органелл клетки; аппарат Гольджи также уплотняется, прижимается к ядру и формирует так называемую акросому, смещается на апикальный конец клетки: центриоли, напротив, смещаются на противоположный полюс ядра и располагаются одна ближе к ядру (проксимальная центриоль), другая дальше (дистальная центриоль);

3. из дистальной центриоли начинает расти жгутик, представляющий собой орган движения сперматозоида. Отметим, что у некоторых видов сперматозоиды лишены жгутика (круглые черви, ракообразные). Вокруг основания жгутика, если он есть, располагаются митохондрии в виде спирального чехлика; по-видимому, они поставляют энергию для движения жгута:

4. вся или почти вся цитоплазма отторгается; зрелый сперматозоид практически ее лишен.

В зрелых половых клетках все жизненные процессы подавлены: клетки фактически находятся в анабиотическом состоянии. Это используется в практике для транспортировки яиц и спермы в замороженном виде. У подавляющего числа животных при нормальном развитии именно оплодотворение служит толчком к стремительному выходу яйцеклетки из анабиотического состояния.

В результате 1-го деления созревания половина хромосомного набора выталкивается в очень маленькую клетку, которая называется первым редукционным, или полярным (в старых руководствах — направительным), тельцем. Впоследствии эта клетка делится на две столь же малые, и никакого участия в дальнейшем развитии они не принимают (за исключением некоторых случаев партеногенеза; см. гл. 3). Яйцевая клетка после выделения I редукционного тельца называется ооцитом II порядка. Второе деление созревания осуществляется путем выделения II редукционного тельца таких же размеров, как и I. После его выделения ооцит II порядка превращается в зрелое яйцо. Биологический смысл резкой неравномерности делений созревания очевиден: невыгодно дробить на части накопленный в процессе роста яйцеклетки запас питательных веществ.

Лишь у немногих видов (некоторые кишечнополостные; из иглокожих — ,морские ежи) мейоз доходит до конца без участия сперматозоида, внедряющегося в яйцеклетку. У большинства животных течение мейоза останавливается па некотором этапе созревания (возникает, как говорят, блок мейоза), и для дальнейшего его протекания требуется оплодотворение яйцеклетки сперматозоидом (или действие другого активирующего агента). Различают следующие три типа блока мейоза.

1. Мейоз останавливается на стадии диакинеза, т. е. участие сперматозоида необходимо для протекания обоих мейотических делений. Этот тип блока мейоза наблюдается у губок, отдельных представителей плоских, круглых и кольчатых червей, моллюсков и щетинкочелюстных. Удивительным образом сюда же относятся три представителя млекопитающих: собака, лиса и лошадь.

2. Мейоз останавливается на метафазе 1-го деления созревания. Такой блок мейоза отмечен у некоторых губок, немертин, кольчатых червей, моллюсков и почти у всех насекомых.

3. Мейоз останавливается на метафазе 2-го деления созревания. Сюда относятся почти все хордовые. У летучих мышей блок мейоза происходит на анафазе 2-го деления созревания. Именно на этих стадиях созревания происходит овуляция яйцеклетки у млекопитающих. Лишь оплодотворение позволяет завершиться ее созреванию и перейти к дальнейшему развитию.

Поляризация яйцеклетки

Как недавно говорилось, полюс яйцеклетки, на котором выделяются редукционные тельца, называется анимальным, а противоположный ему — вегетативным. Эта анимально-вегетативная поляризация яйцеклетки решающим образом ориентирует последующие морфогенетические процессы: за редкими исключениями первые две борозды делений дробления оплодотворенной яйцеклетки проходят по взаимно перпендикулярным анимально-вегетативным меридианам, пересекаясь на анимальном и вегетативном полюсах, а у взрослых животных передне-задняя ось тела либо совпадает с анимально-вегетативной осью яйцеклетки (так называемые протаксонные животные — многощетинковые черви, позвоночные и др.), либо перпендикулярна ей (плагиаксонные животные — малощетинковые черви, некоторые членистоногие).

Первые морфологические проявления поляризации яйцеклетки приурочены к периоду вителлогенеза: у большинства яйцеклеток желток откладывается преимущественно в вегетативном полушарии, а ядро ооцита оттесняется в анимальное полушарие, где больше свободной цитоплазмы. Но только в период делений созревания, а точнее, в период выделения II редукционного тельца поляризация становится устойчивой и необратимой. Это доказывается следующим опытом, поставленным французским ученым Геррье на яйцеклетках моллюсков (виноградный слизень). Посредством центрифугирования яйцеклетки после выделения I редукционного тельца веретено 2-го деления созревания смещалось со своего обычного положения и II редукционное тельце выделялось не под I тельцем, как обычно, а в другой точке поверхности яйцеклетки. Оказалось, что в последующем развитии таких яйцеклеток ось делений дробления, а отсюда и передне-задняя ось организма соответствовали точке выделения не I, a II редукционного тельца.

Материальные носители полярности яйцеклетки до сих пор полностью не выявлены: но, судя по всему, они локализованы в плазматической мембране яйцеклетки, а не в цитоплазматических включениях (эти включения и особенно желток можно сместить путем центрифугирования в различные положения, а полярная ось сохранит после этого свою исходную ориентацию). Что касается мембранных структур, ответственных за поляр­ность яйцеклетки, интересные данные получены в последние годы с применением электрофизиологических измерений: при помощи так называемых вибрирующих электродов вокруг ооцитов и яйцеклеток ряда животных и растений обнаружены электрические поля. О наличии такого поля вокруг системы «ооцит— трофоциты» у дрозофилы уже говорилось. Особенно подробно были исследованы электрические поля вокруг яйцеклеток бурых водорослей (фукуса и др. — работы Л. Джаффе и других исследователей). Установлено, что через яйцеклетку фукуса протекает электрический ток плотностью порядка 5 мкА/см², причем в один из полюсов яйцеклетки (из которого впоследствии возникнет ризоид) катионы входят, а из противоположного — выходят наружу. Разность потенциалов между полюсами составляет от 2 до 20 мВ.

Наличие стационарных электрических полей и электрических (ионных) токов объясняется, по-видимому, разной концентрацией ионных каналов и насосов на противоположных полюсах яйцеклеток. На ризоидном полюсе яйцеклетки фукуса сосредоточены преимущественно каналы для ионов Na+ и Са²⁺; на противоположном полюсе — насосы, активно откачивающие эти ионы с затратой энергии, аккумулированной в молекулах АТФ. Приложением внешнего электрического поля можно сместить каналы и насосы (которые представляют собой ассоциации белковых молекул, обладающих некоторым суммарным зарядом) с их естественных положений. В результате и яйцеклетка в целом изменит свою полярность. Из этих опытов следует, что расположение ионных каналов и насосов однозначно определяет полярность яйцеклетки.

Подобные же электрические поля обнаружены вокруг яйцеклетки шпорцевой лягушки: здесь концентрация ионных каналов выше в анимальном, а насосов — в вегетативном полушарии. Электрические поля в системе «ооцит—трофоциты» определяются, по-видимому, тем же обстоятельством; каналы локализованы преимущественно в мембране трофоцитов, а насосы — в мембране ооцита. До сих пор неизвестно, является ли такой электрофизиологический механизм поляризации яйцеклеток универсальным и единственным, но несомненно, что он играет существенную роль в поддержании полярности.

Оболочки яйцеклетки

Поверх плазматической мембраны яйцо может быть одето еще несколькими оболочками. Различают первые (желточные), вторичные и третичные оболочки. Первичные оболочки представляют собой производные плазматической мембраны яйцеклетки. Они присущи яйцеклеткам почти всех животных (кроме губок и большинства стрекающих), но особенно хорошо развиты у позвоночных, где они пронизаны уже упоминавшимися выше выростами яйцеклетки и фолликулярных клеток. При малых увеличениях микроскопа такая оболочка выглядит поэтому радиально исчерченной и называется zona radiata. Первичная оболочка яиц млекопитающих похожа на блестящий ободок и называется zona pellucida. Возможно, что ее внешняя часть формируется выделениями фолликулярных клеток. Первичные оболочки видоизменяются и достраиваются после оплодотворения яйцеклетки.

Вторичные оболочки (хорион) образуются в яичниках и представляют собой исключительно продукт выделения фолликулярных клеток. Они есть далеко не у всех яиц и лучше выражены, например, у насекомых. В хорионе имеется одно или несколько узких отверстий (микрополе), через которые сперматозоид проникает в яйцо.

Третичные оболочки выделяются железами яйцевода. В ряде групп позвоночных (химеровые рыбы, амфибии, рептилии, птицы) они развиты очень сильно. Поразительной сложности достигают третичные оболочки у акуловых и химеровых рыб. Часто эти оболочки имеют вытянутую форму, и яйцо в начале развития заполняет только часть пространства внутри плотной роговой третичной оболочки. Последняя представляет собой как бы «люльку», размеры которой точно подогнаны к размеру и форме зародыша перед вылуплением. У птиц третичные оболочки представлены белком, двумя слоями подскорлуповой пергаментной оболочки и скорлупой. Названные компоненты выделяются последовательно расположенными железами яйцевода но мере движения яйца по яйцеводу вниз. Двигаясь по яйцеводу, яйцо вращается благодаря сокращениям гладкой мускулатуры стенок яйцевода, о чем можно судить по винтовой закрученное халаз — плотных тяжей белкового вещества, которые поддерживают желток в менее плотной массе белка. Интересно, что передне-задняя ось зародыша расположена всегда перпендикулярно направлению движения яйца по яйцеводу, а направление от хвоста зародыша к голове совпадает с направлением вращения яйца. Эта закономерность была впервые отмечена Карлом Бэром и называется правилом Бэра. До сих пор правило Бэра не получило полного объяснения.

Классификация яйцеклеток по распределению желтка.

Желток распределен по клетке неравномерно. Чем больше желтка, тем большая неравномерность в его распределении наблюдается. Выделяют:

• изолецитальные - равномерно распределен желток (ланцетник, морской еж). У млекопитающих яйцеклетка вторично изолецитальная, так как происходит ее трансформация в процессе эволюции в связи с потерей желтка.

• телолецитальные - желток распределен неравномерно, скапливаясь у одного полюса яйцеклетки, который называется вегетативным. Другой полюс, в котором располагается ядро и другие органелл и включения, называется анимальным. Кроме того, яйцеклетки могут быть умеренно телолецитальными (амфибии) или резко телолецитальными (рыбы, птицы).

• центролецитальные - когда желток скапливается в центре (насекомые).

Таким образом, в процессе гаметогенеза формируются зрелые половые клетки. Они отличаются от соматических:

1)гаплоидным набором хромосом, а значит, невозможностью обычного размножения и обычного метаболизма;

2)резко измененным ядерно-цитоплазматическим отношением (в обычных соматических клетках ЯЦО 1:6- 1:10; у сперматозоида ЯЦО составляет 1;0,2 - 1:0,5; а у яйцеклетки- 1:500)

3. Нормальный метаболизм клетки может осуществляться только при теснейшем взаимодействии ядра и цитоплазмы: у половых клеток очень необычный обмен веществ, он находится в состоянии депрессии.

4. Половые клетки - это высоко специализированные клетки, обладающие многими специальными, выработавшимися в процессе эволюции приспособлениями для выполнения специфических функций: встреча клеток, их соединение, защита зиготы.

5. Из-за высокой специфичности и необычного обмена веществ эти клетки нуждаются в — особых условиях обитания, защитных и питательных структурах (оболочки яйцеклетки).

Цитоплазма яйцеклетки окружена плазматической мембраной. Во время оплодотворения она регулирует поступление в яйцеклетку некоторых ионов (главным образом, Na) и способна сливаться с плазматической мембраной сперматозоида. К плазматической мембране снаружи примыкает желточная оболочка. Образованная гликопротеинами. Она играет важную роль в обеспечении видовой специфичности прикрепления сперматозоида при внешнем оплодотворении. Снаружи у многих видов животных располагается студенистый гликопротеиновый слой, одна из главных функций которого - привлечение или активация сперматозоида. У млекопитающих снаружи от цитолеммы лежит прозрачная оболочка. Она, в свою очередь окружена слоем фолликулярных клеток лучистого венца, который доставляет яйцеклетке питательные вещества.

Особое внимание следует уделить слою цитоплазмы, располагающемуся непосредственно под цитолеммой - кортикальный слой. Цитоплазма этого слоя имеет более упорядоченную структуру, чем цитоплазма более глубоких слоев, и в ней содержатся высокие концентрации глобулярных молекул актина. При оплодотворении молекулы актина полимеризуются, образуя микрофиламенты. Они необходимы для осуществления клеточного деления; кроме того, микрофиламенты участвуют в образовании микроворсинок, способствующих проникновению сперматозоида в клетку. В кортикальном слое располагаются кортикальные гранулы, содержащие протеолитические ферменты, мукополисахариды и т.н. белок гиалинового слоя. Ферменты и мукополисахариды участвуют в защите яйцеклетки от проникновения сверхчисленных сперматозоидов; белок гиалинового слоя формирует оболочку оплодотворения.

СПЕРМАТОГЕНЕЗ. Процесс развития мужских половых клеток - сперматозоидов - называется сперматогенезом. В сперматогенезе различают 4 фазы: размножение, рост, созревание и формирование. Подробно сперматогенез будет рассмотрен в частной гистологии. Здесь приводятся лишь его основные особенности.

На протяжении периода размножения мужские половые клетки представлены сперматогониями. Это мелкие округлые клетки, делящиеся митозом. Они подразделяются на темные и светлые сперматогонии. Темные сперматогонии являются истинными стволовыми клетками, устойчивы к действию вредных факторов и редко делятся митозом. Светлые сперматогонии делятся на А и В-сперматогонии. А-сперматогонии являются полустволовыми клетками, способными к частым митотическим делениям. При делении каждой такой сперматогонии могут возникать либо две А-сперматогонии, либо одна А- и одна В-сперматогония. В-сперматогонии также способны делиться митозом, но при этом не происходит цитотомии, и клетки оказываются связанные между собой цитоплазматическими мостиками. Возникают клоны (ассоциации) клеток.

После некоторой паузы В-сперматогонии вступают в период роста, в течение которого превращаются в сперматоциты первого порядка. Доля периода роста характера значительный рост ядра и цитоплазмы развивающихся клеток, их размеры увеличиваются в четыре и более раз.

Сперматоциты I порядка митозом не делятся, но вступают в период созревания, который состоит из двух последовательных делений мейоза (мейоз I и мейоз II).

Мейоз I называется редукционным делением, так как в ходе его происходит уменьшение в два раза количества хромосом с формирование гаплоидного генома. Мейоз I имеет сложную профазу, состоящую из 5 стадий: лептотены, зиготены, пахитены, диилотены и диакинеза.

В стадию лептотены хромосомы спирализуются и становятся видны в виде длинных тонких нитей. В стадию зиготены гомологичные хромосомы тесно сливаются друг с другом. В это время в них происходит кросинговер - обмен генами. В стадию пахитены хромосомы сильно спирализуются и укорачиваются. Диплотена характеризует­ся расщеплением хромосом на хроматиды и образованием тетрад. В диакинезе хромосомы еще более утолщаются и несколько отходят друг от друга.

Таким образом, в профазу мейоза 1 происходит подготовка к редукции числа хромосом.

В метафазу гомологичные пары хромосом располагаются в экваторе клетки. Эго ключевой момент подготовки к редукции хромосом.

В анафазу к полюсам отходят целые гомологичные хромосомы, и этот момент является началом редукции генома.

В телофазу происходит цитотомия, в результате чего образуются два сперматоцита II порядка с гаплоидным набором хромосом. Их хромосомы состоят из двух хроматид.

Второе деление мейоза (мейоз II) называется эквационным, или уравнительным. Оно начинается сразу после мейоза I и протекает по типу обычного митоза. В анамейоза II к полюсам отходят хроматиды, а в результате телофазы образуются сперматиды, содержащие вместо хромосом хроматиды. Сперматиды, как и сперматоциты второго порядка, содержат гаплоидный набор хромосом, каждая из которых представлена однхроматидой.

Все образующиеся в процессе сперматогенеза клетки (В-сперматогонии, сперматоциты I и II порядка, а также сперматиды) остаются связанными между собой цитоплазматическими мостиками в клеточные ассоциации, или клоны. Окончательное разделение клеток происходит в фазу формирования. Сохранение цитоплазматических мостиков между клетками имеет очень большой биологический смысл. Оказывается, что для полноценной дифференцировки сперматозоидов необходим весь диплоидный геном и продукты его деятельности. Во-первых, потому, что в исходном диплоидном геноме могут содержаться дефектные, летальные аллели генов, и клетка, получившая их, погибнет, если не будет обеспечена продуктами нормального аллеля, находящегося в ядрах клеток, «о получивших. Во-вторых, как известно, одни мужские половые клетки получают Х-, другие - Y- половую хромосому. Каждая из них содержит много важных генов, необходимых для развития сперматозоидов. Поэтому благодаря цитоплазматическим мостикам развивающиеся мужские половые клетки получают продукты деятельности диплоидного генома.

Фаза формирования является самой продолжительной фазой сперматогенеза. В процессе ее из сперматид образуются сперматозоиды. Часто эту фазу называют спермиогенезом. Она длится дольше всех остальных фаз (около 50 суток). Процесс спермиогенеза начинается с образованием из комплекса Гольджи вначале акробласта, а затем акросомы, которая содержит ферменты для разрушения яйцевых оболочек. Центросома, состоящая из двух центриолей, перемещается в противоположный полюс. Проксимальная центриоль прилежит к ядру, а дистальная делится на две части. Из одной части образуется жгутик, который превращается в осевую нить хвостика. Вторая часть играет роль базального тельца. Образуются элементы цитоскелета: сегментированные колонны, плотные волок­на, продольные столбы с ребрами.

Цитоплазма сперматозоида сильно редуцируется, а ядро становится вытянутым, компактным и гипербазафильным. На заключительных этапах формирования сперматозоиды отделяются от соединяющей их друг с другом общей цитоплазмы и становятся свободными. Оставшийся после отделения объем цитоплазмы (остаточные тельца) подвергается фагоцитозу.

ОВОГЕНЕЗ. Принципиально протекает сходно со сперматогенезом, но имеет ряд отличий. Исходными клетками в овогенезе являются первичные половые клетки (гонобласты), развивающиеся в раннем эмбриональном периоде с женской половой железе -яичнике. Эти клетки входят в состав эпителия индифферентной половой железы. В дальнейшем этот эпителий вырастает в виде тяжей в мезенхиму первичной почки (мезонефроса), а затем распадается на отдельные островки (шары Пфлюгера). В составе этих островков находятся половые клетки и окружающие их эпителиоциты (в дальнейшем - фоликулярные клетки). Гонобласты превращаются в овогонии. Эти мелкие клетки вступают в фазу размножения и интенсивно делятся митозом. В результате к концу эмбрионального развития их число достигает 7 млн. К моменту рождения период размножения заканчивается. Начиная с конца 3-го месяца эмбриогенеза и до рождения девочки одни овогонии превращаются в овоцит 1 порядка, другие же продолжают делиться. После рождения размножение овогоний прекращается, все они превращаются в овоциты I порядка, которые блокируются на стадии диплотены первого мейотического деления.

Далее овоциты I порядка вступают в длительный период роста. Период роста делится на две части: период малого, или медленного роста (длится от рождения до полового созревания), и период большого или быстрого роста (происходит циклически на протяжении каждого менструального цикла). В период быстрого роста идет подготовка к мейозу. Таким образом, период роста может составлять 12 - 50 лет. Третья фаза овогенеза - созревание - начинается перед овуляцией. Происходит первое мейотическое деление, образуется овоцит П порядка, который вступает во второе мейотическое деление, но блокируется в метафазе. Завершение созревания инициируется оплодотворением. В отличие от сперматогенеза возникающие в результате двух делений мейоза клетки не равны по размерам. Из овоцита порядка образуется крупный овоцит II порядка и очень мелкое редукционное тельце. Первое редукционное тельце также может делиться на два редукционных тельца. Следовательно, в результате двух делений образуется одна яйцеклетка и три редукционных тельца, которые вскоре погибают. Яйцеклетка теряет центриоли.

Отличия сперматогенеза от овогенеза

СПЕРМАТОГЕНЕЗ	ОВОГЕНЕЗ
Фаза размножения происходит только с момента полового созревания и продолжается в течение всей жизни	Фаза размножения происходит только в эмбриональном периоде и непродолжительное время после рождения
Фаза роста сразу следует за размножением, короткая	Фаза роста очень длительная, делится на малый рост и большой рост
Фаза созревания характеризуется равномерным делением сперматоцитов.	Фаза созревания характеризуется неравномерным делением овоцитов
Есть фаза формирования	Фаза формирования отсутствует
"Экономичность" сперматогенеза: из одной сперматогонии образуется 4 сперматозоида	"Расточительность" овогенеза: из одной овогонии образуется одна крупная яйцеклетка и три мелких редукционных тельца
Продолжается в течение всей жизни мужчины	Прекращается после менопаузы

ОПЛОДОТВОРЕНИЕ. Это процесс слияния мужской и женской половых клеток, который приводит к образованию одноклеточного зародыша - зиготы. Происходит в ампулярной части яйцевода. Перед оплодотворением сперматозоиды активируются под влиянием слизистого секрета яйцевода. Это явление называется капацитацией. Во время капацитации происходят существенные изменения белковых компонентов цитолеммы спермиев: некоторые вещества удаляются, другие белки существенно модифицируются. Эти изменения играют важную роль для последующей акросомной реакции. Одновре­менно сперматозоиды гиперактивируются, их двигательная способность резко возрастает, что способствует их проникновению через лучистый венец и блестящую оболочку.

Для оплодотворения необходимо около 200 миллионов сперматозоидов. В эякуляте человека содержится около 300 млн сперматозоидов, которые сохраняют способность к оплодотворению в течение 2 сут. Из них только около 200 достигают воронковой части яйцеводов, где происходит оплодотворение. При низком содержании сперматозоидов эякуляте (так называемая олигозооспермия) из-за недостаточной литической активности оплодотворения не происходит.

Очевидно, определенную роль в сближении сперматозоидов и яйцеклетки имеет хемотаксис. По предложению М. Гартмана (1940) вещества, продуцируемые яйцеклеткою и сперматозоидом или содержащиеся в поверхностных слоях цитоплазмы и влияющие неподвижность сперматозоидов, названы гамонами (гормонами гамет). При этом сперматозоиды вырабатывают хемотаксические вещества адрогамоны, а яйцеклетка - гиногамоны. Яйцеклетка содержит гиногамоны 1 и 2. Гиногамон 1 активирует движение спермиев. а гиногамон 2, или фертилизин, агглютинирует их. Андрогамон 1 спермиев блокирует их движение, а андрогамон 2 растворяет оболочку яйца. В последнее время, однако, путем наблюдения за половыми клетками при экстракорпоральном оплодотворении установлено, что никакого хемотаксиса при оплодотворении не существует. Встреча сперматозоида и яйцеклетки происходит случайно, но возникшее кратковременное взаимодействие между ними приводит к очень прочным межклеточным контактам.

Сперматозоиды достигают яйцеклетки через 2 часа после осеменения и окружают ее. За счет синхронного движения жгутиков сперматозоидов яйцеклетка начинает совершать вращательные движения. После вступления в контакт с фолликулярными клеткам!! лучистого венца наступает акросомная реакция - выделение из акросом сперматозоидом ферментов. Морфологическим проявлением акросомной реакции является слияние акросомной мембраны с цитолеммой спермия в передней части головки. Для акросомной реакции большую роль играет быстрое поступление внутрь головки спермия ионов кальция, который запускает синтез циклических нуклеотидов и повышает активность АТФазы. Это приводит к увеличению внутриклеточного рН и включению акросомной реакции.

Из ферментов акросомы наибольшее значение имеют гиалуронидаза и трипсиноподобный фермент акрозин. Они воздействуют на лучистый венец и разрыхляют его: расщепляют связи между клетками, в результате чего последние диссоциируют, создавая возможность проникновения спермиев к блестящей зоне. Важную роль играет также денудация яйцеклетки в яйцеводах - частичное или даже полное освобождение яйцеклетки от клеток лучистого венца. При годной денудации спермин сразу взаимодействуют с блестящей зоной.

Блестящая зона является более существенным барьером на пути сперматозоидов. Вначале спермин связываются со специфическими рецепторами на блестящей зоне. Наиболее известным рецепторным белком для сперматозоидов является гликопротеид ZP3 (аббревиатура от zona pellucida - блестящая зона, оболочка). Дополнительным рецептором является ZP2. Прикрепление сперматозоидов к блестящей оболочке является видоспецифическим. После прикрепления к блестящей оболочке спермия ферменты, связанные с внутренней акросомной мембраной, растворяют тот небольшой участок зоны, к которому прикрепился спермий. Активные движения хвостика позволяют сперматозоиду мигрировать через блестящую оболочку за 5-10 мин.

Касание одного из сперматозоидов оолеммы яйцеклетки приводит к образованию на поверхности воспринимающего бугорка. Оолемма содержит систему рецепторов для взаимодействия с рецепторами спермия. После взаимодействия и слияния плазматиче­ских мембран спермия и яйцеклетки мембраны спермия включаются в состав ооплазматической мембраны, а головка спермия внедряется в ооплазму.

Оплодотворением называют слияние сперматозоида с яйцеклеткой, завершающееся объединением их ядер в единое ядро оплодотворенного яйца — зиготы. Сперматозоид выполняет две функции. Первая — активация яйца, побуждение его к началу развития. Эта функция не специфична для сперматозоида: в качестве активирующего фактора он может быть заменен рядом физических или механических агентов. Развитие яйцеклетки без участия сперматозоида называется партеногенезом. Другая функция сперматозоида, в выполнении которой он уже незаменим,— внесение в яйцеклетку генетического материала отца.

Взаимодействие половых клеток — гамет — можно разделить на три фазы: 1) дистантные взаимодействия, осуществляющиеся на некотором расстоянии, до соприкосновения гамет; 2) контактные взаимодействия, происходящие при непосредственном соприкосновении поверхностей гамет; 3) процессы, протекающие после вхождения сперматозоида в яйцо.

Дистантные взаимодействия гамет

Они направлены на повышение вероятности встречи сперматозоидов с яйцеклеткой. По большей части эти взаимодействия осуществляются через посредство хемотаксиса — движения сперматозоидов по градиенту концентрации некоторых веществ, выделяемых яйцеклеткой. Хемотаксис достоверно показан для многих групп животных, особенно беспозвоночных: моллюсков, иглокожих и полухордовых. Специфические хемотактические факторы выделены из яйцеклеток морских ежей: 10-аминокислотный пептид сперакт из яйцеклеток Strongylocentrotus purpuratus и 14-аминокислотный пептид резакт из третичной оболочки Arbacia punciulata. В течение секунд после введения экстрактов этих веществ в морскую воду сперматозоиды соответствующего вида начинают двигаться вверх по градиенту их концентрации.

В движении сперматозоидов млекопитающих по верхним отделам яйцевода существенное значение имеет явление реотаксиса: их способности двигаться против встречного течения жидкости в маточных трубах.

Контактные взаимодействия гамет

Они начинают осуществляться с момента контакта сперматозоида с третичной оболочкой яйцеклетки. Первый этап этих взаимодействий получил название акросомной реакции. Иногда эта реакция может быть вызвана не только контактом с желточной оболочкой яйцеклетки, но также соударением сперматозоида с любой твердой поверхностью или же повышением концентрации Са²+. Внешнее, видимое при небольших увеличениях проявление этой реакции—выброс так называемой акросомной нити в сторону яйцевой оболочки. Тонкие электронно-микроскопические исследования сперматозоидов, фиксированных в период выбрасывания акросомной нити, показали следующее.

Процесс начинается со слияния мембраны акросомы с наружной мембраной сперматозоида. Затем слившиеся мембраны разрываются, и происходит экзоцитоз содержимого акросомного пузырька. При этом из него изливаются спермолизины—ферменты, растворяющие третичную оболочку яйцеклетки. После этого внутренний участок мембраны акросомы начинает быстро выпячиваться, в результате чего образуется одна или целый пучок так называемых акросомных трубочек (или микроворсинок), которые и выглядят при малом увеличении как нити. Акросомная микроворсинка растет в результате быстрой сборки (или изменения конформации) фибриллярного сократительного белка актина, образующего ее структурную основу. У голотурии акросомная микроворсинка удлиняется за несколько секунд на 90 мкм. Момент соприкосновения акросомной микроворсинки с внутренней, желточной оболочкой яйцеклетки — решающий для взаимного узнавания яйцeклeтки и сперматoзoидa.

Это узнавание осуществляется, в случае «правильной» встречи сперматозоида и яйцеклеткой того же вида, благодаря комплементарному взаимодействию особого белка (биндина), встроенного в мембрану акросомной микроворсинки (бывшая внутренняя мембрана акросомного пузырька) с соответственным рецептором на желточной оболочке яйцеклетки. Даже у близких между собой видов биндины различаются по составу. Заключенные, таким образом, до акросомной реакции внутри акросомного пузырька биндины экспонируются (становятся доступными) для связывания рецепторами благодаря выворачиванию и росту акросомной микроворсинки.

Акросомная реакция сопровождается и регулируется следующими процессами молекулярного уровня. Контакт с полисахаридами желточной оболочки яйцеклетки делает плазматическую мембрану сперматозоида более проницаемой для ионов Са²⁺ и Na+, которые поступают в цитоплазму из внешней среды. Повышение внутриклеточной концентрации Са²⁺ и является тем фактором, который вызывает экзоцитоз акросомного пузырька, высвобождение спермолизинов и экспозицию биндинов. С другой стороны, повышение внутриклеточной концентрации Na+ приводит к оттоку протонов (Н+) из цитоплазмы наружу (здесь действует механизм так называемого Na+/Н+ обмена) и возрастанию цитоплазм атического рН. Именно последним фактор одновременно повышает подвижность сперматозоидов (активируя диненновую АТФазу — фермент, поставляющий энергию для жгутикового движения) и стимулирует полимеризацию актина, что способствует быстрому удлинению акросомной микро-ворсинки. Чуть позже мы увидим, что весьма сходные, хотя и более сложно регулируемые, процессы протекают в яйцеклетке в первые моменты после ее активации.

Вслед за реакцией узнавания (образованием комплекса между биндином и его рецептором желточной оболочке) сперматозоида и яйцеклетки желточная оболочка последней лизируется, после чего па яйцеклетке образуется бугорок оплодотворения, направленный навстречу акросомной микроворсинке. Этот момент считается началом процесса активации яйцеклетки. Формирование бугорка оплодотворения, как и акросомной микроворсинки, сопровождается полимеризацией актина. Мембраны верхушки акросомной микроворсинки и бугорка оплодотворения сливаются между собой, и по образовавшемуся сквозному каналу содержимое сперматозоида (прежде всего ядро и по крайней мере одна из центриолей, но нередко также и хвостовая часть) переходит внутрь яйцеклетки. Участок мембраны сперматозоида встраивается в мембрану яйцеклетки и может сохраняться длительное время, иногда обнаруживаясь иммунологическими методами до стадии личинки (у морского ежа).

Дальнейший ход, реакции активации яйцеклетки связан, по современным представлениям, с включением в действие так называемой инозитолфосфатной системы регуляции, все компоненты которой в неактивном виде предсушествуют в плазматической мембране яйцеклетки. Основные компоненты этой системы, подробно рассматриваемой в курсах молекулярной биологии,— производное углевода инозита фосфатидилино-зитол-4,5-дифосфат (сокращенно РIР₂) и фермент фосфолипаза С. Находясь предварительно в неактивной форме, фосфолипаза С активируется в результате контакта между мембранами сперматозоида и яйцеклетки (эта активация осуществляется через посредство также локализованного в мембране G-белка, меняющего свою конформацию после взаимодействия биндина с мембранным рецептором) и расщепляет PIP₂ на остающийся в мембране диацилглицерол (DAG) и выходящий в цитоплазму инозитолтрифосфат (IРз). DAG с помощью другого мембранного фермента, протеинкиназы С, стимулирует работу мембранного механизма, транспортирующего ионы Na⁺ внутрь клетки и протоны — наружу (Na⁺/H+-o6менник). Возрастание же внутриклеточного рН стимулирует подъем синтеза белка в ци­топлазме яйцеклетки и синтез ДНК в мужском и женском ядрах.

В свою очередь, выделившийся в цитоплазму IР₃ стимулирует высвобождение ионов Са²⁺ из внутриклеточного депо связанного Са²⁺ - эндоплазматического ретикулума. Быстрое повышение концентрации Са²⁺ также участвует в стимуляции синтеза белка и ДНК и обусловливает наиболее явный признак реакции активации яйцеклетки; экзоцитоз так называемых кортикальных альвеол (иногда не вполне правильно называемых кортикальными гранулами). Это многочисленные пузырьки, содержащиеся в кортикальном (поверхностном) слое неоплодотворенной яйцеклетки. Со стимуляцией ионами Са²⁺ процессов экзоцитоза мы уже познакомились на примере экзоцитоза акросомного пузырька.

При экзоцнтозе кортикальных альвеол из них высвобождаются в узкое пространство между плазматической мембраной яйцеклетки и плотно примыкающей к ней желточной оболочкой следующие вещества: 1) протеолитический фермент, разрывающий связи между плазматической мембраной и желточной оболочкой,— вителлиновая деламиназа; 2) протеолитический фермент, освобождающий осевшую на желточной оболочке сперму от связен с этой оболочкой,— сперм-рецепторная гидролаза; 3) гликопротеид, втягивающий воду в пространство между желточной оболочкой и плазматической мембраной и вызывающий тем самым их расслоение: в результате между желточной оболочкой и плазматической мембраной яйцеклетки возникает обширное пространство, называемое перивителлиновым. Образование перивителлинового пространства — наиболее отчетливый признак активации яйцеклетки; 4) фактор, способствующий затвердеванию желточной оболочки (которую теперь называют оболочкой оплодотворения); 5) структурный белок гиалин, участвующий в формировании гиалинового слоя, располагающегося у многих яйцеклеток (например, морского ежа) над плазматической мембраной.

Одновременно происходят сборка и перераспределение элементов цитоскелета (в первую очередь актиновых микрофиламентов) в кортикальном слое яйцеклетки. Кортикальный слой в результате приобретает сократимость, необходимую для осуществления делений дробления. Образование оболочки оплодотворения надежно предохраняет яйцеклетку от проникновения излишних сперматозоидов — полиспермии.

Независимо от инозитольной системы регуляции в первые секунды после контакта гамет резко повышается проницаемость плазматической мембраны яйцеклетки для внешнего Na⁺, что приводит к падению трансмембранного потенциала яйцеклетки от отрицательного (порядка —60 мВ) до слабо положительного (около +10 мВ). Это падение потенциала осуществляет так называемый быстрый блок полиспермии, так как в яйцеклетки с положительным трансмембранным потенциалом дополнительные сперматозоиды проникнуть уже не могут.

Ниже приводится хронология некоторых событий, происходящих в яйцеклетке морского ежа после оплодотворения. Она показывает, насколько быстро эти события разворачиваются.

Время, с

Связывание гамет О

Подъем трансмембранного потенциала (быстрый блок полиспермии) менее 3

Слияние мембран сперматозоида и яйцеклетки 30

Начало подъема концентрации Са²⁺ 30

Экзоцитоз кортикальных альвеол 30—60

Время, мин

Подъем потребления кислорода 1—2

Увеличение рН цитоплазмы 1—5

Деконденсация хроматина сперматозоида 2—12

Активация синтеза белка начиная с 5—10

Инициация синтеза ДНК в ядрах обоих гамет 20—40

Митоз 60—80

Образование клеточной перегородки (1-е деление дробления) 85—95

Синтез белков, начинающийся, как мы видели, уже в первые минуты после активации яйцеклетки, идет исключительно на запасенных в период оогенеза матрицах (молекулах мРНК, находящихся до активации яйцеклетки в зарепрессированном состоянии в составе информосом) и на тогда же накопленных рибосомах. Присутствие ядра яйцеклетки или сперматозоида для активации синтеза белка не требуется. Активация осуществляется, таким образом, на уровне трансляции и требует, с од­ной стороны, дерепрессии информосом (сбрасывания белка, блокирующего функцию мРНК), с другой — ассоциации отдельных рибосом в полирибосомы. Именно эти, процессы еще не вполне ясным образом активируются повышением рН и Са²+.

Таким образом, активация яйцеклетки — чрезвычайно быстрая и широкая по охвату реакция, вовлекающая в себя буквально все компоненты яйца. Она является примером кооперативной, самосогласованной и лавинообразно протекающей реакции с положительными обратными связями.

Сперматозоид внутри яйца

У большинства животных сперматозоид входит в яйцеклетку целиком, включая хвостовую часть; у некоторых видов жгутик остается на поверхности. Но, и оказавшись внутри яйцеклетки, жгутик сперматозоида не играет никакой роли в дальнейшем движении последнего. Сперматозоид сразу же поворачивается шейкой по ходу дальнейшего движения; вокруг центриоли возникает характерное «полярное сияние», образованное микротрубочками. Хроматин в ядре сперматозоида деспирализуется. Ядро сперматозоида называют теперь мужским про нуклеусом. Хроматин ядра яйцеклетки после завершения делений мейоза тоже деспирализуется. Это ядро называется женским пронуклеусом.

Прежде чем сблизиться, пронуклеусы проделывают сложные движения («танец пронуклеусов»). Сначала мужской пронуклеус движется внутрь яйца перпендикулярно поверхности и независимо от положения женского пронуклеуса. Этот отрезок пути называют «дорожкой проникновения». Затем оба пронуклеуса движутся навстречу друг другу по «дорожке копуляции». Движение мужского пронуклеуса осуществляется, по-видимому, благодаря «отталкиванию» растущих микротрубочек полярного сияния от поверхностного слоя яйцеклетки.

После сближения пронуклеусов наступает кариогамия - объединение их хромосомных наборов. Кариогамия происходит всегда только после завершения яйцеклеткой делений созревания (как говорилось в предыдущей главе, у большинства животных именно вхождение сперматозоида в яйцеклетку стимулирует завершение этих делений). У тех немногих видов, где сперматозоид проникает в уже зрелую яйцеклетку (например, у морского ежа), кариогамия выражается в непосредственном слиянии пронуклеусов; образуется единое ядро зиготы. В тех случаях, когда между вхождением сперматозоида и кариогамией проходит более длительный срок, оболочки пронуклеусов растворяются еще до их сближения, и хромосомы спирализуются. Тогда кариогамия выражается в том, что хромосомы обоих пронуклеусов располагаются в одной плоскости—плоскости метафазной пластинки 1-го митотического деления оплодотворенного яйца.

При кариогамии или незадолго перед ней в хромосомах обоих пронуклеусов всегда происходит удвоение ДНК. Таким образом, кариогамия непосредственно переходит в 1-е деление зиготы. Существует мнение, что одну или даже обе центриоли веретена этого деления вносит с собой сперматозоид. У некоторых кольчатых червей на концах веретена 1-го деления зиготы центриоли резко неравны по величине. Предполагают, что большая из них перешла из яйцеклетки, а меньшая — из сперматозоида. Вопрос этот, однако, до конца не решен.

Для яйцеклеток морского ежа и ряда других животных полиспермия — нежелательное явление: если в яйцеклетку проникает больше одного сперматозоида (что может случиться при слишком большой концентрации спермы), дальнейшее развитие идет неправильно. В случае проникновения двух сперматозоидов (диспермное оплодотворение) 1-е деление дробления может превратиться в так называемый 4-полюсный митоз, полюса которого образованы разделившимися центриолями двух сперматозоидов. Патологическое явление 4-полюсного митоза сослужило большую пользу науке: выдающийся цитолог Т. Бовери в 1903 г. доказал с его помощью неравнокачественность хромосом. Схема его рассуждений была такой. При диспермном оплодотворении исходное число хромосом в зиготе — 3n по одному гаплоидному набору от каждого сперматозоида и один гаплоидный набор от женского пронуклеуса). В результате 1-го деления дробления число хромосом удваивается и становится равным 6n. Каждая из 4 клеток получает в среднем 6n.: 4 = 3n:2 хромосом. Поскольку для нормального развития достаточно и гаплоидного числа хромосом (см. ниже о гаплоидных партеногенетиках), имеющегося количества хромосом (при условии, что все хромосомы равнокачественны) более чем достаточно для нормального развития всех клеток. В действительности, однако, лишь немногие клетки из большого количества диспермных зародышей нормально развиваются. Используя формулы комбинаторики и зная число хромосом в гаплоидном наборе морского ежа, Бовери подсчитал вероятность того, что в результате случайного распределения хромосом клетка получит хотя бы один полный гаплоидный набор. Эмпирически наблюдаемая частота нормального развития отдельных клеток оказалась достаточно близкой именно этой величине. Замечательная работа Бовери — один из редких примеров чи­сто математического обоснования биологических закономерностей.

Перемещения компонентов яйца после оплодотворения. Ооплазматическая сегрегация

Непосредственно после проникновения сперматозоида (или воздействия партеногенетического агента) начинаются интенсивные перемещения цитоплазмы яйцеклетки (ооплазмы). Иногда при этом происходит расслоение, отмешивание различных составных частей ооплазмы, что обозначается как ооплазматическая сегрегация. В ходе этого процесса намечаются основные, хотя и далеко не все, элементы пространственной организации зародыша. Поэтому данный этап развития называют также проморфогенезом: имеется в виду, что в это время как бы расставляются вехи для будущих морфогенетических процессов.

Ооплазматическая сегрегация протекает у различных видов с неодинаковой степенью подробности и на разных стадиях раннего развития. Здесь мы рассмотрим лишь те процессы ооплазматической сегрегации, которые протекают до начала дробления яйцеклетки. Сегрегация в течение дробления будет рассмотрена в следующей главе.

У некоторых кишечнополостных сегрегация ограничивается расслоением ооплазмы на внешний ободок эктоплазмы (иногда окрашенный различными пигментами и бедный питательными включениями) и внутреннюю массу эндоплазмы, богатую желтком и другими запасными питательными включениями. Уже такое достаточно простое расслоение влияет на последующие процессы развития, определяя в яйцах гипогенетических медуз радиальную установку веретен делений дробления.

На вегетативном полюсе яйцеклетки брюхоногого моллюска Lymnaea (прудовик) вскоре после оплодотворения формируется четко отграниченный сектор так называемой вегетативной полярной плазмы; после делений созревания вещества полярной плазмы быстро растекаются под поверхностью яйцеклетки в направлении анимального полюса. Наиболее существенные сегрегационные процессы в яйцеклетках моллюсков происходят позже, в период их дробления.

У морского ежа до оплодотворения под всей поверхностью яйца рассеян красный пигмент — эхинохром. После оплодотворения он концентрируется в виде пояска в экваториальной зоне яйца.

В перечисленных случаях сегрегационные процессы симметричны по меньшей мере относительно полярной оси яйца. Теперь рассмотрим такие случаи, когда сегрегация нарушает полярную симметрию и приводит к выделению в яйцеклетке некоторой меридиональной плоскости, соответствующей сагиттальной плоскости будущего зародыша. Именно в этих случаях

Наиболее ясно выражается проморфологическое значение сегрегационных процессов. Самыми наглядными примерами могут служить яйца асцидий и амфибий.

В яйцах асцидий процессы сегрегации хорошо заметны благодаря разной окраске составных частей яйца. Неоплодотворенное яйцо асцидий Styela содержит гомогенно рассеянные по всему кортикальному полю желтые гранулы. После оплодотворения они приходят в движение и текут сначала к вегетативному полюсу, а затем несколько поднимаются к анимальному полюсу по той стороне яйца, куда проник сперматозоид. Там они располагаются под экватором в виде так называемого желтого серпа. На противоположной стороне яйца появляется другой серп, состоящий из светло-серого компонента. Вегетативное полушарие заполняется ооплазмой, богатой желтком и митохондриями, а анимальное — прозрачной безжелтковой цитоплазмой. Каждый из названных компонентов ооплазмы дает впоследствии начало определенной структуре: желтый серп — мезодерме, светло-серый серп — хорде; через середины этих серпов и проходит сагиттальная плоскость: цитоплазма вегетативного полушария соответствует энтодерме, анимального — эктодерме. В области желтого серпа присутствует накопленная в оогенезе мРНК мышечных белков.

В яйцеклетках амфибий положение сагиттальной плоскости и проходящей в ней дорсовентральной оси также определяется процессами ооплазматической сегрегации, которые протекают в первые десятки минут после оплодотворения. Наиболее отчетливый наружный признак формирования дорсовентральности в яйцеклетках хвостатых и некоторых бесхвостых амфибий — появление так называемого серого серпа, т. е. серповидного участка поверхности с относительно малым количеством пигмента, расположенного поблизости от экватора яйцеклетки. В нормальном развитии серый серп всегда появляется напротив точки вхождения сперматозоида. В области серого серпа возникает позже, при гаструляции дорсальная губа бластопора.

По современным данным, решающим для определения дорсовентральности будущего организма несоответственно положения серого серпа является поворот оплодотворения. Он сводится к повороту в вертикальной плоскости примерно на 30° всего кортикального слоя (кортекса) яйцеклетки (толщина которого у шпорцевой лягушки составляет от 2 до 5 мкм) относительно внутренней массы желтка. Именно плоскость этого поворота совпадает с сагиттальной плоскостью, а направление поворота — с вентродорсальным направлением: та сторона яйцеклетки, с которой частицы кортикального слоя опускаются, становится вентральной, а сторона, на которую они поднимаются,— дорсальной. Поскольку непигментированный вегетативный кортекс светлее пигментированного анимального, сектор дорсальной области, по которой поднимается вегетативный кортекс, и выглядит как серый серп. Сама «дорсализация» области D может быть инициирована двумя процессами: (1) установлением контакта между вегетативной зоной кортикального слоя и особой, специфической зоной внутренней цитоплазмы (заточкована); (2) асимметричным перераспределением наиболее тяжелой вегетативной фракции желтка: желток поднимается на будущей дорсальной стороне, образуя там желточную стенку, и опускается на будущей вентральной стороне.

Интересно, что аналогичные процессы взаимного скольжения кортикального слоя и внутренней цитоплазмы яйцеклетки можно вызвать искусственным поворотом яйцеклетки в произвольной вертикальной плоскости в первые десятки минут после оплодотворения. Если закрепить яйцеклетку в повернутом положении, то кортикальный слой останется неподвижным, а внутренняя цитоплазма будет перетекать относительно него под действием силы тяжести. Теперь та сторона яйцеклетки, откуда внутренняя цитоплазма оттекает, станет дорсальной (там возникает серый серп, иногда дополнительный к основному), а противоположный — нейтральной. Очевидно, что соотношения между дорсовентральной осью будущего организма и взаимными перемещениями слоев яйцеклетки в данной искусственной ситуации такие же, как и в норме, хотя запускаются они раз­ными факторами: в норме — сперматозоидом (точнее, спермастером) а в эксперименте — просто силой тяжести.

Поворот оплодотворения, как нормальный, так и индуцированный экспериментально, подавляется агентами, препятствующими сборке микротрубочек,— колхицином, нокадазолом, ультрафиолетовым облучением или просто охлаждением. Яйцеклетки, подвергнутые этим воздействиям вскоре после оплодотворения, в дальнейшем дробятся и формируют некоторые ткани, но возникшие из них зародыши остаются радиальио-симметричными и не имеют дорсальных структур (хорды, сомитов, нервной трубки с ее производными). Таким образом, микротрубочки необходимы для осуществления поворота оплодотворения и обусловленной им дорсализации. Предполагается, что микротрубочки осуществляют поворот оплодотворения следующим образом. По-видимому, все они формируются поблизости от центриоли сперматозоида, в области слияния пронуклеусов. Микротрубочки, достигшие в процессе своего роста вегетативного кортекса яйцеклетки, полимеризуются там особенно активно и загибаются своими внешними («плюс») концами по направлению будущего поворота кортекса. В этом же направлении вдоль микротрубочек перемешается (транслоцируется) ассоциированный с ними белок кинезин, увлекающий с собой эндоплазматический ретикулум кортикального слоя. Именно это перемещение кортикального материала относительно тяжелого неподвижного желтка и составляет в нормальном развитии поворот оплодотворения. Следовательно, развитие оплодотворенной яйцеклетки начинается с мощного и закономерно ориентированного механохимического процесса.

У ряда видов для ооплазматической сегрегации важное значение имеет сократимость актиновых микрофиламентов кортикального слоя яйцеклетки, активируемая ионами Са²⁺. Так, в яйцеклетке асцидий можно вызвать в произвольном месте образование желтого серпа, если приложить к этому месту вещество, делающее поверхность проницаемой для ионов Са²+,— так называемый кальциевый ионофор. В ооплазматической сегрегации яйцеклетки амфибий также существенную роль играет сокращение того участка ее поверхностного слоя, которого изнутри касается полярная лучистость мужского пронуклеуса. Кроме того, в ооплазматической сегрегации определенную роль играет своеобразное явление взаимного сродства гомологичных внутриклеточных структур: желточных гранул друг к другу, митохондрий к митохондриям и т. п. Из-за этого возникают зоны с преимущественным содержанием того или иного компонента. На протяжении многих лет процессы ооплазматической сегрегации интересовали многих исследователей в связи с самыми 64 глубокими вопросами дифференцировки и морфогенеза. Согласно одной из первых теорий дифференцировки, так называемой теории Дриша—Моргана, именно ооплазматическая сегрегация определяет, в каких областях развивающегося зародыша какие гены будут активированы. Сегодня с этим утверждением согласиться нельзя, по меньшей мере по двум причинам: 1) в период наибольшей выраженности ооплазматической сегрегации у большинства зародышей геном еще не активен; 2) те компоненты ооплазмы, которые сегрегируются,— желток, митохондрии и другие — в большинстве своем неспецифичны и не могут активировать определенные гены. Одно из немногих исключений — половая цитоплазма в яйцеклетках насекомых: она действительно может оказывать прямое влияние на геном будущих гоноцитов, способствуя их превращению в половые клетки. В большинстве же случаев ооплазматическая сегрегация влияет не прямо на конечную дифференцировку клеток, а на ближайшие этапы развития — дробление и бластуляцию. Эти влияния будут рассмотрены в следующей главе.

Партеногенез и андрогенез

Как уже говорилось, яйца многих животных могут быть активированы естественно или искусственно, без помощи сперматозоида. Развитие без участия сперматозоида называют партеногенезом. Естественный партеногенез типичен для летних поколений некоторых ракообразных и коловраток; он обнаружен у пчел, ос, ряда чешуекрылых, а из позвоночных — у некоторых видов ящериц и змей. Успешные опыты по искусственному партеногенезу относятся ко второй половине XIX в. А.А. Тихомирову удалось в 1886 г. стимулировать развитие неоплодотворенных яиц тутового шелкопряда кратковременным нагреванием или потиранием щеткой. Американский биолог Ж. Леб (Loeb) (1859—1924) вызывал партеногенез у яиц морского ежа широким набором агентов — действием гипер - или гипотонической морской воды, кислотами, мочевиной, сахарозой. Французский эмбриолог Э. Батайон (Bataillon) активировал яйцо лягушки уколом иглы, смоченной в лягушиной крови.

У млекопитающих также отмечались случаи вступления яйцеклеток на путь партеногенетического развития либо самопроизвольно, либо под влиянием различных активирующих агентов, например электростимуляции, теплового шока, этанола. Однако развитие таких зародышей всегда останавливалось на ранних стадиях — рожденная партеногенетиков никогда не наблюдалось. В некоторых случаях спонтанного партеногенеза дробящиеся зародыши становятся источниками опухолей яичника - тератом, в которых могут развиваться зачатки органов. Полноценное развитие партеногенетиков у млекопитающих невозможно, по современным данным, потому, что в женских хромосомах заблокированы (в результате метилирования) определенные участки, мужских хромосомах. Именно поэтому самец не может быть заменен у млекопитающих партеногенетическим агентом.

Лишь в редких случаях партеногенетически развивающиеся организмы являются гаплоидами (таковы самцы медоносной пчелы), В большинстве случаев после партеногенетической активации яйцеклетки в ней восстанавливается диплоидный набор хромосом. Существуют два основных способа диплоидизации. При амейотическом партеногенезе выпадает процесс редукции числа хромосом. При мейотическом партеногенезе редукция числа хромосом происходит, но диплоидный набор восстанавливается путем объединения хромосомных наборов обоих ядер, получившихся в результате митотического деления гаплоидного ядра яйцеклетки. Позже мы опишем работы, в которых явления мейотического и амейотического партеногенеза вызывались искусственно в целях управления полом возникающего организма.

Своеобразной разновидностью партеногенеза является гиногенез — оплодотворение спермой другого (родственного) вида, которая лишь активирует яйцеклетку, но не вносит свой генетический материал в геном зародыша. Например, яйца серебряного карася могут быть стимулированы спермой сазана; плотвы, обыкновенного карася. В популяциях гиногенетических животных встречаются только самки. Имеются данные, что гиногенез может быть вызван искусственно термошоком для облучением яйцеклетки.

Андрогенез - явление, обратное партеногенезу, т. е. развитие яйцеклетки с участием только мужского ядра. Известны случаи естественного андрогенеза; андрогенетики встречаются у табака и кукурузы, иногда у тутового шелкопряда.

Андрогенез может быть вызван и искусственно. Еще в начале нашего века были поставлены опыты по оплодотворению фрагментов яиц морского ежа, лишенных собственного ядра. Такая разновидность искусственного андрогенеза, когда оплодотворяется фрагмент яйца, называется мерогонией. Опыты по мерогонии были использованы для решения важнейшего вопроса генетики: передается ли наследственность только через ядро или также через цитоплазму. Так как сперматозоид практически не содержит цитоплазмы, то в случае, если андрогенетический организм будет нести только отцовские признаки, следует исключить цитоплазматическую передачу наследственности. Для опытов по мерогонии брали самца и самку разных видов морских ежей, отличающихся типом строения скелета. У полученных андрогенетиков действительно наблюдался скелет чисто отцовского типа, тогда, как у истинных гибридов скелет был промежуточной формы.

У млекопитающих андрогенез невозможен, так же как партепогепез, и по аналогичным причинам (заблокирование некоторых участков хромосом самца).

Хромосомное определение пола при оплодотворении и партеногенезе

Как известно, в подавляющем числе случаев пол организма определяется набором его половых хромосом (гоносом). Наблюдаются два варианта определения пола: 1) у некоторых животных в диплоидном наборе особи женского пола обладают двумя одинаковыми гоносомами XX, а мужского — разными гоносомами XY или, в частных случаях, при отсутствии хромосомы Y — гоносомами ХО (ноль). Это животные с гетерогаметным мужским полом и гомогаметным женским. Сюда относятся большинство млекопитающих (включая человека), некоторые амфибии, нематоды, моллюски, иглокожие, большинство членистоногих; 2) у других представителей раз­личных систематических групп животных, напротив, гетерогаметен женский пол (гоносомы ZW), а гомогаметен мужской (гоносомы обозначаются как ZZ или XX). К этой категории принадлежат птицы, пресмыкающиеся, а из насекомых — тутовый шелкопряд.

Понятно, что при нормальном оплодотворении оба варианта обеспечивают статистически равный процент мужских и женских особей. Однако при различных типах партеногенеза и при андрогенезе будут возникать особи лишь одного пола. Рассмотрим это на примере гетерогаметного вида — тутового шелкопряда.

Очевидно, что в случае амейотического партеногенеза особи будут иметь те же гоносомы, что и незрелая яйцеклетка, т. е. ZW, и все будут самками. При мейотическом партеногенезе (с последующей аутодиплоидизацией) будут возникать наборы ZZ и WW. Из особей с первым набором будут развиваться самцы, а особи с набором WW нежизнеспособны. Таким образом, при мейотическом партеногенезе будут возникать исключительно самцы. То же самое будет при андрогенезе.

Эти закономерности были успешно использованы в прикладных целях для направленной регуляции пола у тутового шелкопряда Б. Л. Астауровым и В. А. Струнниковым. Поскольку в коконах гусениц мужского пола содержится больше шелка, нежели в коконах самок, было бы выгодно получать преимущественно или исключительно особей мужского пола. Для этого применяют три метода.

1. Андрогенез: ядро яйцеклетки инактивируют кратковременным прогревом или облучением, после чего оплодотворяют. Андрогенез при этом является диспермным: из большого количества проникших в яйцеклетку сперматозоидов лишь у двух пронуклеусы сливаются, образуя диплоидное ядро с хромосомным набором ZZ (Б. Л. Астауров).

2. Мейотический партеногенез, стимулируемый 2-часовым охлаждением яйцеклеток (В. А. Струнников).

3. Метод сбалансированных легален. Была выведена радиационным методом генетически особая порода тутового шелкопряда, у которой в обеих Z-хромосомах самцов имеются летальные гены, расположенные в негомологичных друг другу положениях. У особей с двумя гоносомами, т. е. у самцов, действие каждой летали компенсируется нормальным геном другой гоносомы, и самцы вполне жизнеспособны. У самок же компенсирующая гоносома отсутствует, отчего все они на ранних стадиях развития погибают. Таким образом, этот способ позволяет в неограниченном количестве получать особей только мужского пола (В. А. Струнников).

Это пока что единственные полностью успешные работы по определению пола у животных. Было бы привлекательно решить такую задачу на млекопитающих, но имеющиеся здесь трудности преодолеть пока не удалось. Поскольку, как уже говорилось, партеногенетические особи млекопитающих нежизнеспособны, единственным радикальным способом регуляции пола этих гетерогамных животных было бы разделение «сперматозоидов на самца» и «сперматозоидов на самку», т. е. содержащих либо гоносому X, либо гоносому Y. Пока подходы для такого разделения не найдены. Английские ученые Р. Эдварде и Р. Гарднер извлекали из матки кролика зародышей, цитологически определяли их пол и затем возвращали в матку зародышей определенного пола. Приживалось и успешно развивалось до 20% зародышей с заранее установленным полом.

Рис. Схема вентродорсального поворота кор­тикального слоя яйцеклетки шпорцевой лягушки относительно внутренней цитоплазмы («поворот оплодотворения»): слева — исходная стадия, 40 мин после вхождения сперматозоида; справа — схема поворота, 80 мин после вхождения сперматозоида; кс — кортикаль­ный слой яйцеклетки; мт—микротрубочки; п — пронуклеусы; тес — точка вхождения спермато­зоида; Д — будущая дорсальная губа бластопора. Слева показаны лучи спермастера и встреча двух пронуклеусов, справа — веретено первого деления дробления. Точками обозначена специфическая зона внутренней цитоплазмы яйцеклетки, жирным пунктиром — верхняя граница тяжелой вегетативной фракции желтка, стрелками — направление поворота (по Герхардту с соавторами, изменено)

Рис. Участок стенки эпителия семенных канальцев крысы: 1—ограничивающая мембрана; 2 — сперматогонии типа А; 3 — сперматогонии типа В; 4 — сперматоциты в начале редукционного деления (фаза пахитены); 5 — сперматиды; 6 — клетки Сертоли; 7 — пучки дифференцирующихся сперматозоидов, прикрепившиеся к клетке Сертоли (по Карлсону, 1983)

Рис. А—Ж — последовательные фазы спермиогенеза:

1 — ядро сперматиды; 2 — аппарат Гольджн; 3 — центриоли; 4 — зачаток акросомы; 5 — митохондрии; 6—жгутик; 7— акросома; 8 — проксимальная центриоль; 9 — дистальная центриоль; 10 — ядерное вещество, сосредоточенное в головке сперматозоида; 11-—митохондриальная спираль; 12 —остатки цитоплазмы; 13 — головка; 14 — шейка; 15 — средняя часть; 16 — хвост; 17 — концевой участок хвоста (по Карлсону, 1983).

Рис. Акросомная реакция у сперматозоида кишечнодышащего Saccoglossus kowalevski: А—акросома неактивированного сперматозоида; Б — выделение акросомных гранул; В, Г — последовательные стадии выбрасывания акросомной нити; Д — акросомная нить достигает поверхности яйца; я — ядро сперматозоида; а—акросома; кг — кортикальные гранулы поверхности яйца (по Колвину и Колвин)

Рис. Оплодотворение (фертилизация) яйцеклетки плацентарных млекопитающих (схема):

А - первое деление мейоза, формирование первого полярного тельца, Б - овоцит после овуляции в блоке метафазы 2-го деления мейоза, контакт со спермием приводит к снятию блока мейоза и его завершению, В - выделение второго полярного тельца, образование гаплоидного женского пронуклеуса, митотическое деление первого полярного тельца, Г - сближение мужского и женского пронуклеусов, репликация хромосом, подготовка к митозу (первому делению дробления), Д - митоз зиготы, реплицированные хромосомы располагаются в экваториальной плоскости, Е - анафаза митоза, при завершении деления зиготы возникнут две диплоидные клетки - первые бластомеры