8.2 Методы определения факторов вирулентности микроорганизмов (адгезивности, ферментов агрессии бактерий: гиалуронидазы, лецитовителлазы, лизоцима; токсигенности, гемолизинов)

Адгезивность. Адгезины - поверхностные структуры микроорганизмов (пили, поверхностные белки, тейховые кислоты), способствующие прикреплению возбудителя к клеткам организма и являются обязательными, специфическими факторами, реализирующими патогенность микроба на начальном этапе развития инфекционного процесса. Адгезивность оценивается по способности бактерий прилипать к эритроцитам. Эритроциты крови 1 группы человека смешивают на предметном стекле с чистой исследуемой культурой и инкубируют 30 минут при 37^оС. Делают мазок и подсчитывают индекс адгезии (соотношение количества микробов, адгезированных на эритроцитах к количеству эритроцитов, участвующих в адгезии).

Гиалуронидаза. Гиалуронидазной активностью обладают S.aureus, S.pyogenes,, C.perfringens и др. Гиалуронидаза – экзофермент, разрушающий гиалуроновую кислоту, что обеспечивает прохождение бактерий через соединительную ткань. Для определения гиалуронидазы в опытную пробирку вносят бульонную исследуемую культуру бактерий, гиалуроновую кислоту, в контрольную – только гиалуроновую кислоту. После 20-минутной инкубации в термостате в обе пробирки добавляют 15%-ю уксусную кислоту. При наличии у микробов гиалуронидазы жидкость в опытной пробирке остается гомогенной, при отсутствии – появляется муцина. В контрольной пробирке сгусток муцина образуется всегда в результате взаимодействия гиалуроновой и уксусной кислот.

Лецитовителлаза (летициназа) – экзофермент S.aureus обеспечивающий выживание бактерий на коже, в очагах нагноения, расщепляет липопротеид оболочек клеток. Выявляется в виде помутнения или образования радужных венчиков вокруг колоний на желточно – солевом агаре.

Микробный лизоцим – фермент, оказывающий литическое действие на грамположительные микроорганизмы, участвует в аутолизе и делении бактериальной клетки, придает штамму-продуценту селективные преимущества при колонизации кожных покровов и слизистых. Для определения лизоцимной активности тест-микроба(микрококка) засевают на МПА сплошным газоном, сверху в виде бляшек наносят исследуемую культуру (S. aureus). Инкубируют при 37°С в течение 24 час. Появление зон лизиса микрококка вокруг культуры S. aureus свидетельствует о лизоцимной активности микроорганизмов (о лизисе штаммами S. aureus индикаторного штамма микрококков).

Методы идентификации бактерий по токсигенности (по способности синтезировать экзотоксин).

1. Биологический метод. Испытуемые культуры или токсины в определенных дозах вводят лабораторным животным с последующей регистрацией их гибели (см. практические навыки 8.1) и расчетом летальных доз.

2. Иммунологические методы с применением стандартных антитоксических антител: реакция нейтрализации токсина (см.практические навыки 9.5), ИФА, РИА и РИФ;

3. ПЦР - выявление гена плазмид, детерминирующего синтез экзотоксина.

Экзотоксины синтезируются в основном грамположительными (S.aureus, S.pyogenes, C.perfringens, C.tetani, C.botulinum, C diphtheriae и др.), также грамотрицательными бактериями (E.coli, V. сholerae и др.)

Идентификация бактерий по гемолитической активности.

Бактериальные гемолизины — мембранотоксины, которые вызывают нарушение целостности мембраны эритроцитов и их лизис. Гемолитической активностью обладают многие патогенные бактерии: S.aureus, S.pyogenes, C. рerfringens, C. tetani, C. botulinum, C. diphtheriae и др.

Исследуемую культуру засевают в чашки Петри с 5%-м кровяным агаром, посевы инкубируют при 37°С в течение 24 ч. Гемолизин, выделяемый растущей культурой бактерий, диффундирует в толщу агара и вызывает лизис эритроцитов, что проявляется в виде светлой зоны вокруг колоний.