- •Практические навыки
- •Содержание
- •Введение
- •1. Соблюдение правил противоэпидемического режима и техники безопасности в бактериологических лабораториях
- •1.1 Основные правила поведения в бактериологической лаборатории
- •1.2 Правила забора материала для микробиологических исследований
- •1.3 Правила забора материала, хранения и транспортировки при особо опасных инфекциях (оои)
- •1.4 Оформление направления на микробиологическое исследование
- •1.5. Дезинфекция в микробиологической лаборатории: рук, рабочего места, выделений больного, предметных и покровных стекол.
- •1.6 Стерилизация лабораторной посуды, подготовка к стерилизации
- •2. Овладение навыками изучения морфологии и тинкториальных признаков микроорганизмов
- •2.1 Этапы приготовления мазка для иммерсионной микроскопии
- •2.2 Овладение методикой микроскопирования с иммерсионной системой
- •2.3 Сложные методы окраски: методы Грама, Циля- Нильсена, Нейссера и Бурри-Гинса Окраска мазка по Граму
- •Окраска мазка по Циль-Нильсену
- •Окраска по Нейссеру
- •Окраска по способу Ожешки
- •Обнаружение капсул по методу Бурри-Гинса
- •2.4 Методы определения подвижности бактерий Микроскопические
- •Бактериологические
- •3. Овладение навыками изучения культуральных, биохимических признаков микроорганизмов и фагочувствительности бактерий
- •3.1 Механические и биологические методы выделения чистых культур аэробных и факультативно-анаэробных бактерий
- •3.2 Метод Дригальского
- •3.3 Методы создания анаэробных условий (механические, физические, химические и биологический)
- •Физические методы удаления кислорода
- •Биологический метод удаления кислорода по Фортнеру
- •3.4 Этапы выделения чистой культуры анаэробных бактерий
- •3.5 Вирусологические методы
- •3.6 Реакция гемагглютинации (рга)
- •3.7 Методы индикации бактериофагов (качественные и количественные методы)
- •Индикация фага на твердой питательной среде по Отту.
- •3.8 Реакция фаголизиса
- •3.9 Реакция фаготипирования s.Aureus
- •4. Овладение навыками идентификации микроорганизмов по генетической структуре
- •4.1 Полимеразная цепная реакция (пцр)
- •4.2 Метод рекомбинации
- •5. Освоение принципов бактериологической оценки качества стерилизации и навыков определения антибиоткочуствительности
- •5.1 Контроль эффективности физического способа стерилизации (кипячение) бактериологическим методом
- •5.2 Определение антибиотикочусвтвительности бактерий методами «бумажных дисков» и серийных разведений Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом «бумажных дисков»
- •Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений
- •6. Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника
- •7. Определение общего микробного числа (метод коха) и санитарно - показательных микробов воздуха
- •8. Биологический метод и методы идентификации бактерий по вирулентности
- •8.1 Заражение экспериментальных животных (биологический метод)
- •8.2 Методы определения факторов вирулентности микроорганизмов (адгезивности, ферментов агрессии бактерий: гиалуронидазы, лецитовителлазы, лизоцима; токсигенности, гемолизинов)
- •8.3 Методы определения персистентных свойств бактерий: капсулообразования, антигенов-ингибиторов фагоцитоза, антилизоцимной, антикомплементарной и антиинтерфероновой активностей
- •9. Иммунологичекие методы идентификации микроорганизмов и серодиагностики инфекционных заболеваний
- •9.1 Реакция агглютинации (ра) на стекле.
- •9.2 Развернутые реакции агглютинации Видаля, Вейгля и Райта
- •9.3 Рпга – реакция пассивной гемагглютинации (определение напряженности поствакцинального противодифтерийного и противоскарлатинозного антитоксических иммунитетов)
- •9.4 Реакция преципитации (рп): термопреципитации по Асколи и рп в геле по Оухтерлони
- •9.5 Идентификация с.Рerfringens по токсигенности в реакции нейтрализации токсина антитоксином (рн) на мышах
- •9.6 Идентификация вируса клещевого энцефалита в реакции нейтрализации вирусов (рн) на мышах
- •9.7 Реакция торможения гемагглютинации (ртга) (определение серотипа вируса гриппа а)
- •9.8 Реакции связывания комплемена: рск Борде-Жангу, рск, Вассермана, рибт – реакции иммобилизации бледной трепонемы
- •9.9 Опсоно-фагоцитарная реакция
- •9.10 Реакции непрямой иммунофлюоресценции (риф) (экспресс-диагностика и серологическая диагностика гриппа а)
- •9.11 Иммуноферментный анализ (ифа): конкуретный способ (определение hBs-аг вируса гепатита в) и непрямой способ (серологическая диагностика вич - инфекции)
- •9.12 Серологическая диагностика вич-инфекции с помощью реакции иммуноблоттинга
- •Рисунки
- •Список использованной литературы Основная литература
- •Дополнительная литература
- •3. Микробиология, вирусология: руководство к практическим занятиям: учебное пособие / Зверев в.В. ( и др.); под ред. В.В. Зверева, м.Н. Бойченко. – м.:гэотар- Медиа, 2015. – 360 с.:ил.
- •4. Медицинская микробиология и иммунология: Учебник / в.Н.Мальцев, е.П.Пашков; под ред. В.В. Зверева. – м.: Практическая медицина, 2014. – 512 с.:ил.
- •Коллектив авторов
3.5 Вирусологические методы
Для выделения и культивирования облигатных паразитов (вирусов, риккетсий и хламидий) применяются вирусологические методы: заражение тканевых культур, куриного эмбриона и восприимчивых лабораторных животных. Вирусологическое исследование проводится в два этапа: выделение вируса и идентификация вируса. Материалами для вирусологического исследования могут быть отделяемое носоглотки, испражнения, кровь и другие материалы в зависимости от локализации вируса. Вирусологические методы также применяются для культивирования некоторых факультативных паразитов, например, микоплазмы, бруцелл, франциселл, легионелл и др.
Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость с целью
выделения чистой культуры вируса гриппа и идентификации.
1-й этап. Выделение вируса (культивирование вируса).
Для заражения используют куриные эмбрионы 8-14 дневного возраста.
Ход работы:
1) перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушной камеры;
2) яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху;
3)стерилизация скорлупы на тупом конце яйца в такой последовательности: спиртом, 2 % йодной настойкой ещё раз спиртом и обжиганием;
4) над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы;
5) Пастеровской пипеткой вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры;
6) отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем;
7) инкубация эмбриоа в термостате в течение 2-3 суток при 370 С.
2-й этап. Идентификация выделенной чистой культуры вируса.
Ход работы:
яйцо устанавливают на подставке так, чтобы воздушное пространство было наверху;
обработка скорлупы последовательно спиртом, йодом, опять спиртом и обжиганием;
осторожно снимают лейкопластырь, рассекают и сбрасывают скорлупу, определяют гибель эмбриона, отсасывают аллантоисную жидкость и разливают в пробирки;
идентификация вируса проводится по гемагглютинирующей активности (по способности склеивать куриных эритроцитов) в реакции гемагглютинации.
3.6 Реакция гемагглютинации (рга)
Применяется для идентификация вирусов по гемагглютинирующей активности. Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами (имеющие гемагглютинин – гликопротеид суперкапсида), способны гемагглютинировать эритроцитов различных животных. Например, вирусы гриппа – куриных эритроцитов.
Компоненты реакции:
исследуемый материал – аллантоисная жидкость(гемагглютинин вируса гриппа?);
5% суспензия куриных эритроцитов;
физиологический раствор.
Существует два способа постановки реакции: капельный способ на стекле и объемный способ в пробирке.
Капельный способ на стекле:
Опыт:1 капля аллантоисной жидкости + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов.
Контроль: 1 капля физ. раствора + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов. Хорошо перемешать сначала контрольную каплю, затем- опытную.
Наличие гемагглютинации (выпадение хлопьев красного цвет) в опыте при ее отсутствии в контроле (гомогенное покраснение) указывает на содержание вируса гриппа в исследуемом материале. Гемагглютинация – это склеивание эритроцитов под влиянием гемагглютинина вируса. Вид вируса гриппа (А,В,С) дифференцируют по антигенной структуре с помощью РСК, ИФА, а серотип – РТГА (практические навыки 9.7). Окончательную идентификацию также можно провести по генетической структуре (ПЦР).