Генная инженерия

Генная инженерия — раздел биотехнологии, связанный с целена­правленным конструированием in vitro новых комбинаций генетичес­кого материала, способного размножаться в клетке и синтезиро­вать определенный продукт.

Генная инженерия решает следующие задачи:

1. получение генов путем их синтеза или выделения из кле­ток;

2. получение рекомбинантных молекул ДНК;

3. клонирование генов или генетических структур;

4. введение в клетку генов или генетических структур и син­тез чужеродного белка.

Получение генов. Известны два способа искусственного син­теза генов вне организма — химический и ферментативный. Хи­мическим путем в 1969 г. американский ученый Г. Корана с сотр. синтезировали ген аланиновой тРНК дрожжей. Этот ген включал 77 пар нуклеотидов, последовательность которых была

уже ранее расшифрована. Ученые сначала синтезировали фраг­менты ДНК длиной от 5 до 12 нуклеотидов, затем соединили их в определенном порядке при помощи открытого к тому времени фермента лигазы. Однако ген аланиновой тРНК при введении в клетку кишечной палочки или бесклеточную среду не функцио­нировал. Оказалось, что он не имел регуляторных элементов — промотора, где локализована точка инициации синтеза, и терми­нальных кодонов, которые дают сигнал о завершении синтеза иРНК В 1976 г. Г. Корана с сотр. осуществили синтез гена супрессорной тирозиновой тРНК протяженностью 126 пар нук­леотидов. Были также синтезированы примыкающие к гену регу-ляторные участки: промотор (52 пары нуклеотидов) и термина­тор (21 пара нуклеотидов) и прикрепленные к концам полимера тетрануклеотиды ААТТ и ТТАА. В этом случае искусственно синтезированный ген, встроенный в геном мутантного фага Т4, при введении в живую кишечную палочку оказался работоспо­собным. В 1979 г. в нашей стране под руководством Ю. А. Ов­чинникова и М. Н. Колосова химическим путем с помощью ферментов были синтезированы гены гормонов человека и жи­вотных — энкефалина и брадикинина.

Химико-ферментативный синтез довольно широко применя­ют в генной инженерии для получения мелких генов. Для полу­чения генов животных, растений и человека, размер которых составляет 1000—3000 нуклеотидов, этот метод слишком сложен и пока неосуществим. Ученые нашли более простой способ по­лучения таких генов.

В 1970 г. Г. Темин с сотр. обнаружили фермент обратную транскриптазу (ревертазу). В 1972 г. было открыто, что некото­рые онкогенные вирусы при помощи обратной транскриптазы могут синтезировать ДНК, используя в качестве матрицы иРНК. Дальнейшие исследования показали, что матрицами для образо­вания копий ДНК могут служить не только РНК онкогенных вирусов, но и другие иРНК. Это открывало принципиальные возможности ферментативного синтеза любых индивидуальных генов (ДНК), используя их РНК-копии. Под ферментативным синтезом гена имеют в виду транскрибирование комплементар­ной нити ДНК (гена) на молекулах РНК в пробирке. Система для синтеза представляет собой раствор, в котором содержатся все четыре нуклеотида, входящих в состав ДНК, ионы магния, фермент обратная транскриптаза (ее получают из онкогенных вирусов) и матричная (информационная) РНК, кодированная геном, копию которого ставится задача снять. На иРНК обрат­ная транскриптаза синтезирует комплементарную ей цепь ДНК, а затем на ней при помощи этого же фермента синтезируется вторая цепь ДНК. В результате получается ген по структуре такой же, как и тот, на котором была синтезирована иРНК.

Этим способом в лабораториях многих стран создан целый ряд генов. В нашей стране йод руководством В. А. Энгельгардта был разработан проект «Ревертаза» — программа синтеза генов с помощью этого фермента. В осуществлении проекта участвовали ведущие отечественные и зарубежные институты. В итоге с 1974 по 1978 г. были синтезированы гены глобина голубя, кролика и человека, а также гены митохондрий печени крыс, часть гена, кодирующего иммунные белки мышей, и др.

Гены, синтезированные при помощи обратной транскрипта­зы, не имеют регуляторных участков и функционально неактив­ны. Поэтому транскрибирование копий ДНК рекомендуется проводить с про-мРНК, которые имеют все необходимые копии регуляторных частей гена.

Кроме изложенных способов ген можно получить путем выде­ления с помощью трансдуцирующих фагов. Таким путем в 1969 г. был впервые выделен лактозный ген кишечной палочки. Однако такой способ получения генов не всегда пригоден, так как предусматривает строгие места локализации фагов. Поэтому используются и другие приемы выделения фрагментов ДНК с нужными для переноса генами.

Рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы). Важным собы­тием для развития генной инженерии было открытие в клетках бактерий ферментов, способных разрезать молекулу ДНК в стро­го определенных местах. Ферменты эти называются рестрикти-рующими эндонуклеазами или рестриктазами, а процесс «разреза­ния» молекулы ДНК называется рестрикцией. С рестриктазами связаны дальнейшие успехи в молекулярной биологии. Они стали одним из главных элементов генной инженерии. Участок ДНК, узнаваемый определенной рестриктазой, включает специ­фическую последовательность из о—8 пар оснований, являющих­ся палиндромом. Палиндромом называется последовательность ДНК, которая считывается одинаково в обоих направлениях, начиная от З'-конца каждой цепи. Например, рестриктаза E.coli под названием EcoRI узнает последовательность

Г 4 ААТТ Ц

Ц ТТАА t Г

и, прикрепляясь к ней, делает по одному однонитевому надрезу с обеих сторон, т. е. разрезает ее в симметричных участках, указанных стрелками. В результате двухцепочная молекула ДНК, если была кольцевой, вследствие разрыва приобретает линейное строение. На краях молекулы образуются липкие концы, представленные однонитевыми участками из четырех нуклеоти­дов: на одном конце будет последовательность ААТТ, на дру­гом — ТТАА. При наличии липких концов молекула ДНК из линейной формы вновь способна замкнуться в кольцо без до­полнительной обработки. Были обнаружены рестриктазы, узнаю­щие самые разнообразные последовательности нуклеотидов. На­пример, рестриктаза EcoRII узнает последовательность ЦЦТГГ.

К настоящему времени известно свыше 200 рестриктаз, харак­терных для разных видов микроорганизмов. Это открывает новые возможности для экспериментаторов. Огромные молекулы выс­ших организмов включают большое число мест разрезания для ферментов рестрикции. При обработке ДНК рестриктазами обра­зуются многочисленные фрагменты ДНК, в которых представле­ны отдельные гены. Затем гены можно соединять в определенные структуры. Остающиеся в такой структуре разрывы нитей ДНК воссоединяются лигазой. Имеется и другой способ получения фрагментов ДНК с липкими концами. Он состоит в том, что выделенные или искусственно синтезированные участки ДНК об­рабатывают эндонуклеазой, укорачивающей участки ДНК с обоих концов, после чего при помощи фермента полинуклеотидтран-сферазы пристраивают к этим концам последовательности адени-ловых и тимидиловых нуклеотидов. Длина липких поли-А и поли-Т составляет 50—100 нуклеотидов. При встраивании гена в вектор используются оба рассмотренных метода и часто совместно.

Рекбмбинантные ДНК. Рекомбинантная ДНК —это искусст­венно полученная молекула ДНК. Она имеет форму кольца, включает ген (гены), составляющий объект генетических манипу­ляций, и так называемый вектор, обеспечивающий размножение рекомбинантной ДНК и синтез в клетке хозяина определенного продукта, кодируемого внесенным геном. Векторами являются те компоненты рекомбинантных ДНК, которые способны акцепти­ровать чужеродные гены и обеспечивать их репликацию в клетках хозяина. Векторы должны обладать следующими особенностями: 1) иметь свойства репликона; 2) нести субстратные участки для рестриктаз, иначе невозможна встройка ДНК; 3) содержать один или несколько маркирующих генов, чтобы по фенотипу можно было определить факт его передачи. Исследования показали, что эффективными векторами являются плазмиды. Из них в качестве векторов используются Col El, pSC 101 и др. Из вирусов в каче­стве векторов используют фаги A., SV 40 и их производные. Векто­ры придают рекомбинантной молекуле способность воспроизво­диться независимо от хромосомы клетки бактерии.

Соединение вектора с фрагментом ДНК может производиться следующими путями: при помощи липких концов, образующихся в ДНК под действием эндонуклеаз рестрикции; дополнительного син­теза полинуклеотидных фрагментов каждой из цепей ДНК (поли-А и поли-Т); соединения тупых концов при помощи Т4-лигазы.

На рисунке 25 показаны ферментативный синтез гена и встраивание его в векторную плазмиду. Слева на иРНК при помощи обратной транскриптазы синтезируется цепь ДНК (кДНК), затем иРНК удаляют щелочью и при помощи ДНК-полимеразы достраивают вторую цепь кДНК, экзонуклеазой уко­рачивают обе цепи ДНК и концевой трансферазой пришивают к их концам поли-Т-последовательности. На этом же рисунке

Рис. 25. Ферментативный синтез гена н встраивание его в векторную плазмиду

(по С. М. Гершевдону)

справа показано, что кольцевую ДНК векторной плазмиды раз­резают рестриктазой и превращают ее в линейную форму, затем экзонуклеазой цепи укорачивают и концевой трансферазой при­шивают к ним поли-А-последовательности. На последнем этапе соединяют оба типа молекул ДНК и получают гибридную моле­кулу — векторную плазмиду со встроенным в нее синтезирован­ным геном. Разрывы в цепях ДНК воссоединяют лигазой.

В данном случае было известно, какой ген включен в вектор­ную плазмиду. Но в работах по трансгенозу чаще имеют дело со многими фрагментами ДНК, и среди них только единичные включают ген, который подлежит переносу. Для получения фраг­ментов ДНК с определенным геном применяют так называемый способ дробового ружья, который заключается в том, что ДНК механически или ферментами дробится на множество мелких фрагментов, после чего их вслепую гибридизируют с молекулами ДНК вектора. Перед этим ДНК вектора обрабатывают рестрик­тазой для придания им линейной формы и образования липких концов. После введения рекомбинантных молекул в кишечную палочку при помощи селективных сред выделяют те бактерии, в которые попал фрагмент ДНК с нужным геном. Включенный ген обнаруживают по продукту его действия в виде определенно­го вещества (фермент, гормон и т. д.). Размножение в бактериях

идентичных рекомбинантных ДНК называется клонированием. Каждый клон бактерий содержит свою рекомбинантную ДНК. Разрабатываются методы, позволяющие производить замены нуклеотидов в ДНК клонированного гена и тем самым изменять свойства кодируемого этим геном белка.

Введение в клетку рекомбинантных молекул и синтез чужерод­ного белка. Чаще всего рекомбинантные молекулы вводятся в клетки бактерий методом трансформации. Сначала клетки бакте­рий с целью повышения их способности поглощать плазмидную ДНК обрабатывают хлористым кальцием или хлористым барием. После этого в клеточную взвесь вводят раствор с рекомбинантны-ми молекулами. Некоторые из этих молекул проникают внутрь клетки, и часть из них, прикрепясь к мембранам клетки, начинает размножаться и функционировать (рис. 26).

Рис. 26. Типичный опыт генетической инженерии (по Beckingeham—Smith, 1975)

Рис. 27. Функционирование химически синтезированного гена соматостатина человека в клетках Е. coli (no К. Итакуре и др.)

Одно из наиболее важных для практики направлений генной инженерии — конструирование микроорганизмов-продуцентов нужных веществ. Первыми в этом направлении были исследова­ния К. Итакуры и Г. Боейра с соавт. (1977). Им удалось добить­ся экспрессии гена, кодирующего гормон соматостатин в клетках кишечной палочки (рис. 27). Затем в разных странах клетки кишечной палочки использовались для синтеза ряда белков и гормонов человека и животных: инсулина, интерферонов, гормо­на роста, урокиназы, кальцитонина, альбумина, тимозина и др. В лабораториях А. А. Баева, Ю. А. Овчинникова, М. Н. Колосова, Е. Д. Свердлова и др. осуществлена экспрессия генов, кодирую­щих энкефалин, лейкоцитарный интерферон, брадикинин, сома-тотропин и др.

В последние годы уделяется много внимания созданию генно-инженерных вакцин. Получают антигены из рекомбинантных микроорганизмов или культур клеток, в которые введен опреде­ленный ген возбудителя болезни. Этим методом получен матери-. ал для вакцинации против гепатита В, гриппа А, малярии, ящура, бешенства, паравируса свиней и др. В нашей стране произведена обратная транскрипция РНК вируса гепатита А. ДНК, кодирующая вирусный белок гепатита, была пришита к

ДНК вируса оспы. В результате ослабленная культура оспы вы­зывает иммунитет против опасной болезни — гепатита. Вакцина проходит производственное испытание.

Штаммы бактерий, продуцирующие вещества, активные в ор­ганизме человека и животных, могут быть использованы для промышленного производства лекарственных препаратов.

В нашей стране ведутся работы по получению методами ген­ной инженерии суперпродуцентов продуктов, свойственных клеткам, таких, как аминокислоты, витамины, ферменты, а также по созданию культур, активно разлагающих нефть, пласт­массы, разрушающих нафталин, фиксирующих азот, и т. д.

45. (46) Клеточная инженерия у человека и животных (ЭКО, клонирование, трансплантация эмбрионов)

Предпосылкой к развитию клеточной инженерии у человека и животных явилась разработка методов культивирования их соматических клеток на искусственных питательных средах, а также получение гибридов соматических клеток, включая межвидовые гибриды. В свою очередь, успехи в культивировании соматических клеток оказали влияние на изучение половых клеток и оплодотворение у человека и животных. Начиная с 60-х гг., в нескольких лабораториях мира были выполнены многочисленные эксперименты по пересадке ядер соматических клеток в яйцеклетки, искусственно лишенные ядер. Результаты этих экспериментов часто были противоречивы, но в целом они привели к открытию способности клеточных ядер обеспечивать нормальное развитие яйцеклеток (см. гл. VIII).

На основе результатов изучения развития оплодотворенных яйцеклеток в 60-е гг. были начаты также исследования по выяснению возможности оплодотворения яйцеклеток вне организма матери. Очень быстро эти исследования привели к открытию возможности оплодотворения яйцеклеток сперматозоидами в пробирке и дальнейшего развития образованных таким путем зародышей при имплантации их в матку женщины. Дальнейшее совершенствование разработанных в этой области методов привело к тому, что рождение «пробирочных» детей стало реальностью. Уже к 1981 г. в мире было рождено 12 детей, жизнь которым была дана в лаборатории, в пробирке. В настоящее время этот раздел клеточной инженерии получил большое распространение, а количество «пробирочных» детей составляет уже десятки тысяч. В нашей стране работы по получению «пробирочных» детей были начаты в 1986 г. В 1993 году была разработана методика получения монозиготных близнецов человека in vitro, путем разделения эмбрионов на блас-томеры и доращивания последних до 32 клеток, после чего они могли быть имплантированы в матку женщины.

Под влиянием результатов, связанных с получением «пробирочных» детей, у животных тоже была разработана технология, получившая название трансплантации эмбрионов. Она связана с разработкой способа индукции полиовуляции, способов искусственного оплодотворения яйцеклеток и имплантации зародышей в организм животных — приемных матерей. Суть этой технологии сводится к следующему. Высокопродуктивной корове вводят гормоны, в результате чего наступает полиовуляция, заключающаяся в созревании сразу 10—20 клеток. Затем яйцеклетки искусственно оплодотворяются мужскими половыми клетками в яйцеводе. На 7-8-й день зародышей вымывают из матки и трансплантируют в матки другим коровам (приемным матерям), которые затем дают жизнь телятам-близнецам. Телята наследуют генетический статус своих подлинных родителей.

Другой областью клеточной инженерии у животных является получение трансгенных животных. Наиболее простой способ получения таких животных заключается во введении в яйцеклетки исходных животных линейных молекул ДНК. Животные, развившиеся из оплодотворенных таким образом яйцеклеток, будут содержать в одной из своих хромосом копию введенного гена. Больше того, они и будут передавать этот ген по наследству. Более сложный способ получения трансгенных животных разработан на мышах, различающихся по окраске шерстного покрова и сводится к следующему. Вначале из организма беременной серой мыши извлекают четырехдневных зародышей и измельчают их на отдельные клетки. Затем из эмбриональных клеток извлекают ядра, переносят их в яйцеклетки черных мышей, предварительно лишенные ядер. Яйцеклетки черных мышей, содержащие чужие ядра, помещают в пробирки с питательным раствором для дальнейшего развития. Развившиеся из яйцеклетки черных мышей зародыши имплантируют в матки белых мышей. В выполненных по этой методике экспериментах от пяти белых мышей («приемных матерей») было получено 36 мышей, среди которых трое были серыми. Таким образом, в этих экспериментах удалось получить клон мышей с серой окраской шерстного покрова, т. е. клонировать эмбриональные клетки с заданными свойствами. В § 35 мы рассмотрели результаты оплодотворения искусственно лишенных ядер яйцеклеток овец ядерным материалом соматических клеток животных этого же вида. В частности, из яйцеклеток овец удаляли ядра, а затем в такие яйцеклетки вводили ядра соматических клеток (эмбриональных, плодовых или клеток взрослых животных), после чего оплодотворенные таким образом яйцеклетки вводят в матки взрослых овец. Рождающиеся ягнята оказались идентичными овце-донору. Как было отмечено в § 35, такое получение трансгенных животных представляет собой прямой путь клонирования животных с хозяйственно-полезными признаками, включая особей определенного пола.

Трансгенные животные получены также при использовании исходного материала, принадлежащего разным видам, в частности, известен способ передачи гена, контролирующего гормон роста, от крыс в яйцеклетки мышей, а также способ комбинирования блас-томеров овцы с бластомерами козы, что привело к получению гибридных животных (ковец). Эти эксперименты указывают на возможность преодоления видовой несовместимости на самых ранних этапах развития. Особенно заманчивые перспективы открываются (если видовая несовместимость будет преодолена полностью) на пути оплодотворения яйцеклеток одного вида ядрами соматических клеток другого вида. Речь идет о реальной перспективе получения хозяйственно-ценных гибридов животных, которых невозможно получить путем скрещиваний.

Следует отметить, что ядерно-трансплантационные работы еще не очень эффективны. Эксперименты, выполненные на земноводных и млекопитающих, в целом показали, что их результативность является небольшой, причем она зависит от несовместимости между донорскими ядрами и реципиентными овоцитами. Кроме того, препятствием на пути к успехам являются также образующиеся хромосомные аберрации в трансплантированных ядрах в ходе дальнейшего развития, которые сопровождаются гибелью трансгенных животных.

На стыке работ по изучению гибридизации клеток и иммуноло-гических исследований возникла проблематика, связанная с получением и изучением так называемых моноклональных антител. Как отмечено выше (см. § 96), антитела, продуцируемые организмом в ответ на введение антигена (бактерии, вирусы, эритроциты и т. д.), представляют собой белки, называемые иммуноглобулина-ми и составляющие фундаментальную часть защитной системы организма против возбудителей болезней. Но любое чужеродное тело, вводимое в организм, представляет собой смесь разных антигенов, которые будут возбуждать продукцию разных антител. Например, эритроциты человека обладают антигенами не только для групп крови А (II) и В (III), но и многими другими антигенами, включая резус-фактор. Далее, белки клеточной стенки бактерий или капси-да вирусов также могут действовать в качестве разных антигенов, вызывающих образование разных антител. В то же время лимфо-идные клетки иммунной системы организма обычно представлены клонами. Значит, даже только по этой причине в сыворотке крови иммунизированных животных антитела всегда представляют собой смесь, состоящую из антител, продуцируемых клетками разных клонов. Между тем для практических потребностей необходимы антитела только одного типа, т.е. необходимы так называемые моноспецифические сыворотки, содержащие антитела только одного типа, или, как их называют, моноклональные антитела.

В поисках методов получения моноклональных антител швейцарскими исследователями в 1975 г. был открыт способ получения гибридов между лимфоцитами мышей, иммунизированных тем или иным антигеном, и культивируемыми опухолевыми клетками костного мозга. Такие гибриды получили название «гибридомы». От «лим-фоцитарной» части, представленной лимфоцитом одного клона, одиночная гибридома наследует способность вызывать образование необходимых антител, причем одного типа, а благодаря «опухолевой (миэломной)» части она становится способной, как и все опухолевые клетки, бесконечно долго размножаться на искусственных питательных средах, давая многочисленную популяцию гибридом. На рис. 229 показана схема выделения клеточных линий, синтезирующих моноклональные антитела. Линии мышиных клеток, синтезирующих моноклональные антитела, выделяют путем слияния миеломных клеток с лимфоцитами из селезенки мыши, иммунизированной за пять дней до этого желаемым антигеном. Слияние клеток достигают смешиванием их в присутствии полиэтиленгликоля, который индуцирует слияние клеточных мембран, а затем в высеве их на питательную среду, позволяющую рост и размножение только гибридных клеток (гибридом). Размножение гибридомы разводят в жидкой среде, где они растут далее и секретируют антитела в культуральную жидкость, причем только одного типа, к тому же в неограниченных количествах. Эти антитела получили название моноклональных.

Чтобы повысить частоту образования антител, прибегают к клонированию гибридом, т. е. к селекции отдельных колоний гибридом, способных вызывать образование наибольшего количества антител желаемого типа. Моноклональные антитела нашли широкое применение в медицине для диагностики и лечения ряда болезней . В то же время важнейшее преимущество моноклональной технологии заключается в том, что с ее помощью могут быть получены антитела против материалов, которые невозможно очистить. Напротив, можно получить моноклональные антитела против клеточных (плазматических) мембран нейронов животных. Для этого мышей иммунизируют выделенными мембранами нейронов, после чего их селезеночные лимфоциты объединяют с миеломными клетками, а дальше поступают, как описано выше.

46. Природа происхождения вирусов.

Современные представления о вирусах складывались постепенно. В 1892г. Д.И. Ивановский обратил внимание на широко распространенную болезнь табака, при которой листья покрываются россыпью пятен (мозаичная болезнь). После открытия вирусов Ивановским их считали просто очень мелкими микроорганизмами, не способными расти на искусственных питательных средах. Вскоре после открытия вируса табачной мозаики была доказана вирусная природа ящура, а еще через несколько лет были открыты бактериофаги. Таким образом, были открыты три основные группы вирусов, поражающее растения, животных и бактерий. Однако в течение длительного времени эти самостоятельные разделы вирусологии развивались изолированно, а наиболее сложные вирусы — бактериофаги — долгое время считались не живой материей, а чем-то вроде ферментов. Тем не менее, уже к концу 20-х — началу 30-х годов стало ясно, что вирусы являются живой материей, и примерно тогда же за ними закрепились наименования фильтрующихся вирусов, или ультравирусов.

В конце 30-х — начале 40-х годов изучение вирусов продвинулось настолько, что сомнения в живой их природе отпали, и было сформулировано положение о вирусах как организмах. Основанием для признания вирусов организмами явились полученные при их изучении факты, свидетельствовавшие, что вирусы, как и другие организмы (животные, растения, простейшие, грибы, бактерии), способны размножаться, обладают наследственностью и изменчивостью, приспособляемостью к меняющимся условиям среды их обитания и, наконец, подверженностью биологической эволюции, обеспечиваемой естественным или искусственным отбором. Это является, прежде всего, взаимодействием двух геномов — вирусного и клеточного.

По этому поводу были выдвинуты три основные гипотезы. Согласно первой из них, вирусы являются потомками бактерий или других одноклеточных организмов, претерпевших дегенеративную эволюцию. Согласно второй, вирусы являются потомками древних, доклеточных, форм жизни, перешедших к паразитическому способу существования.

Согласно третьей, вирусы являются дериватами клеточных генетических структур, ставших относительно автономными, но сохранившим зависимость от клеток. Третья гипотеза 20—30 лет казалась маловероятной и даже получила ироническое название гипотезы взбесившихся генов. Однако накопленные факты дают все новые и новые аргументы в пользу этой гипотезы. Наряду с этим накопилось значительное число фактов, свидетельствующих о существовании в природе в широких масштабах обмена готовыми блоками генетической информации, в том числе у представителей разных, эволюционно далеких вирусов. В результате такого обмена могут быстро и скачкообразно изменяться наследственные свойства путем встраивания чужеродных генов (заимствование генной функции). Новые генетические качества могут возникнуть также благодаря неожиданному сочетанию собственных и интегрированных генов (возникновение новой функции). Наконец, простое увеличение генома за счет неработающих генов открывает возможность эволюции последних (образование новых генов).