III. План практической работы
Разобрать схему постановки и учёсть результаты ИФА с целью выявления антител в сыворотке крови больного при диагностике ВИЧ.
Для постановки ИФА используются наборы (тест-системы), содержащие все необходимые ингредиенты для реакции. Из дополнительного оборудования необходимы: дозаторы с одноразовыми наконечниками, термостат, шейкер (встряхиватель), вошер (промыватель), ридер (спектрофотометр) для микропланшет. Этапы реакции:
В лунки микропланшета, сорбированные специфическими антигенами, вносят исследуемые сыворотки, положительные и отрицательные контроли. Инкубация. Промывка.
В лунки вносят конъюгат (антиглобулиновую сыворотку с антителами, мечеными ферментом). Инкубация. Промывка.
В лунки вносят субстратно-хромогенную смесь. Инкубация.
В лунки вносят стоп-раствор, останавливающий цветную биохимическую реакцию.
Учет результатов: измеряют оптические плотности контрольных и опытных лунок. По формуле рассчитывают критическое значение оптической плотности (ОП крит.). Сыворотки, давшие ОП равные или выше ОП крит., считаются положительными и в отношении их делается заключение о наличии специфических антител.
ОП крит. = ср. знач. ОП К- + 0,200 |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
где ОП крит. критическое значение оптической
плотности; ср. знач. ОП К- среднее значение
оптической плотности отрицательных контролей;
0,200 коэффициент, устанавливаемый методом
статистической обработки результатов на
предприятии-изготовителе тест-системы.
2. Изучить механизм, зарисовать схему иммуноблоттинга в диагностике ВИЧ.
3. Изучить механизмы прямой и непрямой РИФ для выявления антител к антигенам Chlamidia trachomatis.
Прямая РИФ Непрямая РИФ
1. Материал, содержащий микроорганизмы, 1. Материал, содержащий микроорганизмы,
фиксируется на стекле и обрабатывается фиксируется на стекле и обрабатывается
специфической люминесцентной сывороткой. специфической сывороткой.
2. Инкубация. Промывка. 2. Инкубация. Промывка.
3. Микроскопия мазка с использованием 3. Мазок обрабатывается антиглобулиновой
люминесцентного микроскопа. люминесцентной сывороткой.
4. Инкубация. Промывка.
5. Микроскопия мазка с использованием
люминесцентного микроскопа.