8. Методы определения санитарно-показательных микроорганизмов воды, воздуха и почвы

Санитарно-бактериологическое исследование воды. Отбор проб воды. Методы санитарно-микробиологического контроля качества питьевой воды в отношении ее эпидемической безопасности по показателям СанПиН 2.1.4.559—96 “Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества” и ГОСТ 18963—73 «Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа» проводятся в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.1018-01 (01.07.2001). Методические указания предназначены для лабораторий организаций, предприятий и иных хозяйственных субъектов, осуществляющих производственный контроль, а также органов санитарно-эпидемиологической службы, обеспечивающих государственный и ведомственный санитарно-эпидемиологической надзор за качеством питьевой воды централизованных систем питьевого водоснабжения.

Точность результатов исследования воды зависит от способов отбора, хранения и перевозки проб воды в лабораторию для исследования, а также качества питательных сред, используемых при исследовании. Отбор проб воды производится специально подготовленным лицом (выемщиком проб, лаборантом или помощником санитарного врача) в присутствии представителя организации или учреждения, в ведении которого находится исследуемый водоисточник или водопроводное сооружение.

О выемке составляется акт, в котором указывают местонахождение и наименование сооружения, точки забора и дают краткую характеристику источника или сооружения. Указывают, по чьему заданию производится исследование, цель последнего, время забора (дата и час), должность и фамилия выемщика проб. Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов. Отбор проб производит специалист после прохождения инструктажа по технике выполнения отбора проб для микробиологического анализа. Пробу отбирают в стерильные емкости. Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду запрещается. При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин при полностью открытом кране. При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании. После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком.

На сосуд наклеивают этикетку с указанием номера пробы или же надписывают номер карандашом по стеклу. Доставку проб питьевой воды осуществляют в контейнерах-холодильниках при температуре, 4-10°С. В холодный период года контейнеры должны быть снабжены термоизолирующими прокладками, обеспечивающими предохранение проб от промерзания. При соблюдении указанных условий срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 ч. Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2 ч после забора. Если не может быть соблюдено время доставки пробы и температура хранения, анализ пробы проводить не следует. Пробы питьевой воды должны доставляться в отдельных продезинфицированных контейнерах.

Определение общего микробного числа. Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37°С в течение 24 ч, видимые с увеличением в 2 раза. Из каждой пробы делают посев не менее двух объемов по 1 мл. После тщательного перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. После внесения воды в каждую чашку вливают 8—12 мл (на чашку диаметром 90—100 мм) расплавленного и остуженного до 45—49°С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до застывания агара. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч. Для учета результатов подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 изолированных колоний. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды. Если на одной из 2 чашек подсчет невозможен, результат выдают на основании учета колоний на одной чашке. Если на двух чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают “число КОЕ/ мл — ориентировочно”. Если подсчет колоний на чашках невозможен, то в протоколе отмечают “сплошной рост”.

Метод фильтрации. Основным методом определения общих и термотолерантных колиформных бактерий является метод мембранной фильтрации. Общие колиформные бактерии (ОКБ) — грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37°С в течение 24—48 ч. Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 44°С в течение 24 ч.

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификацией колоний по культуральным и биохимическим свойствам (рис.12). При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл. При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр. При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличение количества фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 мл воды). Фильтры помещают на среду Эндо и чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх, инкубируют посевы при температуре 37°С в течение 24 ч. Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивают через 24 ч. Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ с использованием оксидазного теста, окраски по Граму, определение ферментации лактозы.

При отсутствии общих и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают “не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 мл” и “не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 мл”.

В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 мл воды. Вычисление проводят по формуле:

,

Х — число колоний в 100 мл;

V — профильтрованный объем воды через фильтры, на которых велся учет;

а — число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.

Примеры:

1. При посеве 3 фильтров по 100 мл выросло две колонии в 100 мл, на остальных двух фильтрах нет роста. Число общих или термотолерантных колиформных бактерий будет:

КОЕ ОКБ (ТКБ) в 100 мл

2. При посеве 10, 40, 100 и 150 мл на фильтрах с профильтрованным объемом 40 мл выросло 4 изолированные колонии, с профильтрованным объемом 100—3 ОКБ. Фильтры с объемами 10 мл и 150 мл заросли и учету не подлежат. Суммируют общее число колоний ОКБ (ТКБ) на тех фильтрах, где получены изолированные колонии, и пересчитывают на объем 100 мл.

КОЕ в 100 мл

Окончательный результат выдают: количество КОЕ ОКБ в 100 мл, из них количество КОЕ ТКБ в 100 мл.

Наложение бактериального фильтра на поверхность среды Эндо

Р

Стерилизация мембранного фильтра и фильтрация исследуемого образца воды через стериальный бактериальный фильтр

Инкубация 37ºС в течение 24 ч

Подсчет ярко-малиновых колоний с характерным металлическим блеском, содержащих одиночные грам-, оксидаза- палочки

ис. 12. Метод мембранных фильтров

Титрационный метод. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом может быть использовано при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации; при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ; в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификацией колоний по культуральным и биохимическим тестам.

При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпиднадзор, производственный контроль) засевают 3 объема по 100 мл. При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 мл, 3 объемов по 10 мл, 3 объемов по 1 мл. Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо-пептонную среду, состоящую из 1% пептонной воды, 0,5% NaCl, 0,5% лактозы, индикатор, поплавок. Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации. Посевы инкубируют при 37°С в течение 48 ч. Не ранее 24 час инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо для получения изолированных колоний. Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными и дальнейшему исследованию они не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение делают высев на сектора среды Эндо. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре 37 °С в течение 18—20 ч. При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы.

Для определения термотолерантных колиформных бактерий работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев 2—3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред. Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °С. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре 44°С в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через 4—6 ч. При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °С дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.

При исследовании 3 объемов по 100 мл результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объемов, делается запись в протоколе “обнаружены в 100 мл”.

При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по специальной таблице. Результат сообщают без доверительного интервала.

При отрицательном ответе на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе “не обнаружены в 100 мл”.

Нормативы питьевой воды (ГОСТ 2874-82) — МИКРОБНОЕ ЧИСЛО НЕ БОЛЕЕ 100 в 1 МЛ, ЧИСЛО ОКБ В 1 Л ВОДЫ (коли-индекс) НЕ БОЛЕЕ 3 и (коли-титр) НЕ МЕНЕЕ 333 МЛ.

В ряде случаев проводят определение в воде спор сульфитредуцирующих клостридий и колифагов. Сульфитредуцирующие клостридии — спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре при температуре 44°С в течение 16—18 ч. Колифаги — бактериальные вирусы, способные лизировать Е. coli и формировать при температуре 37°С через 18 ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха. Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), аспирации или фильтрации.

Метод седиментации (метод Коха). Основан на оседании бактериальных частиц под влиянием силы тяжести на поверхности агара открытой чашки Петри. Для проведения метода Коха две чашки Петри с питательным агаром оставляют открытыми в течение 60 минут, после чего посевы инкубируют в термостате при 37ºС. Результаты оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих чашках: при наличии менее 250 колоний воздух считается чистым, 250-500 колоний свидетельствует о загрязнении средней степени, при количестве колонии более 500 — загрязненным. Для обнаружения определенных видов микроорганизмов могут быть использованы специальные питательные среды: кровяной агар (гемолитические стафилококки и стрептококки), ЖСА (золотистый стафилококк). Однако метод оседания не дает полного количественного представления о микрофлоре воздуха, так как на открытых чашках плохо улавливаются тонкодисперсные фракции бактериальных капель и пылевых частиц. Поэтому метод оседания может быть использован в тех случаях, когда отсутствуют другие, более совершенные приборы и методы.

Аспирационный метод основан на ударном действии воздушной струи о поверхность питательной среды. Это более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Для исследования воздуха этим методом применяют аспирационный прибор Кротова. Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью засасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. Воздух в количестве 50—100 л пропускают со скоростью 25 л в минуту над открытой чашкой с мясо-пептонным агаром или со специальной средой. Вращение столика с чашкой Петри обеспечивает равномерное распределение микроорганизмов по всей поверхности питательной среды. К концу заданного времени чашку с посевом воздуха снимают, закрывают ее и помещают в термостат. После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле: ОМЧ = А х 1000/V, где А– количество выросших колоний на чашке, V — объем пропущенного через прибор воздуха, л, 1000 — стандартный объем воздуха в литрах. Допустим, на чашке при подсчете обнаружено 250 колоний, воздух пропускали 2 минуты со скоростью 25 л в минуту. Всего было пропущено 50 л воздуха. ОМЧ=250 х 1000/50=5000 (дм³).

Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды и воздуха в лечебных учреждениях проводятся в соответствии с МУК 4.2.2942-11, разработанные ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора; ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора; ФБУН НИИ Дезинфектологии Роспотребнадзора и утверждены15.07.11.

Исследования бактериальной обсемененности воздушной среды проводят в помещениях лечебных организаций в зависимости от их функционального назначения на следующие санитарно-микробиологические показатели:

- общее количество микроорганизмов в 1 куб. м воздуха (КОЕ/куб. м);

- количество колоний S.aureus в 1 куб. м воздуха (КОЕ/куб. м);

- количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 куб. м воздуха.

Пробы воздуха отбирают аспирационным методом с помощью аппаратов и устройств, разрешенных к применению в установленном порядке. Количество пропущенного воздуха должно составлять 100 куб. дм для определения общего количества микроорганизмов, дрожжевых и плесневых грибов и 250 куб. дм для определения S.aureus. Исследование воздуха седиментационным методом в лечебных учреждениях не допускается.

Для определения общего количества микроорганизмов в 1 куб. м воздуха забор проб проводят на питательный агар типа МПА, СПА, ГРМ-агар и другие, приготовленные согласно инструкциям по применению. Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 48 ч, подсчитывают количество выросших колоний и производят перерасчет на 1 куб. м воздуха. При наличии роста колоний дрожжевых и плесневых грибов их подсчитывают и делают пересчет на 1 куб. м воздуха. В протоколе количество дрожжевых и плесневых грибов указывают отдельно.

Для определения наличия S.aureus забор проб проводят на желточно-солевые среды на основе сред: элективно-солевой агар, стафилококк-агар, маннитол-агар, агар Байд-Паркер. Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37 °С 48 ч. На вышеуказанных средах стафилококк растет в виде круглых, блестящих, маслянистых, выпуклых, пигментированных колоний. Следует учитывать, что стафилококки, выделенные от человека, дают положительную лецитовителлазную реакцию в 60 — 70% случаев. Отвивка на скошенный агар для дальнейшего исследования не менее 2 колоний, подозрительных на стафилококк. Для исследования отвивают прежде всего колонии, дающие положительную лецитовителлазную реакцию (образование радужного венчика). При отсутствии на чашках таких колоний дальнейшему исследованию подвергаются пигментированные колонии, схожие по морфологии со стафилококком. При одновременном наличии на чашках колоний стафилококка, отличающихся по пигменту, следует отвивать не менее двух колоний различного вида. Пробирки с посевом помещают в термостат при 37 °С на 24 ч. После инкубации у выделенных штаммов проверяют морфологию, тинкториальные свойства (окраска по Граму) и наличие плазмокоагулирующей активности в реакции плазмокоагуляции (РПК). Окраску по Граму проводят общепринятым методом. Под микроскопом окрашенные по Граму стафилококки имеют вид фиолетово-синих кокков, располагающихся гроздьями или небольшими кучками ("кружево"). Если культура обладает только плазмокоагулирующей или только лецитовителлазной активностью, то для окончательного ответа требуется учитывать другие признаки, позволяющие определить принадлежность штамма к виду S.aureus (ферментация маннита, гемолитическая активность). При необходимости, после выделения чистой культуры, проводят определение чувствительности/устойчивости к антибиотикам, дезинфицирующим средствам, бактериофагам.

Санитарно-бактериологическое исследование почвы. Отбор проб почвы. Исследование почвы проводят в соответствии методами микробиологического контроля почвы. Методические рекомендации. №ФЦ/4022. — 2004, разработанные сотрудниками Федерального научного центра гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана, Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России, центра ГСЭН в Краснодарском крае, утвержденные 24.12.2004.

Санитарное состояние почвы — совокупность физико-химических, биологических свойств почвы, определяющих качество и степень ее безопасности в эпидемическом и гигиеническом отношении. Состав микрофлоры почвы меняется в зависимости от ее глубины. В поверхностном слое почвы (0 — 10 см) количество микроорганизмов незначительно; это связано с губительным действием прямого солнечного света и низкой влажности почвы. Максимальное количество микроорганизмов обнаруживается на глубине 10 — 30 см. На глубине 1 м выявляются единичные клетки бактерий. Наиболее богата микроорганизмами культурная возделываемая почва (до 5 млрд. клеток на 1 г почвы), наименее — почва, бедная влагой и органическими веществами (200 млн. клеток в 1 г).

Оценка санитарного состояния почвы проводится по результатам анализов почв на объектах повышенного риска (детские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны и т.п.) и в санитарно-защитных зонах по санитарно-бактериологическим показателям, которые делятся на косвенные и прямые:

1) Косвенные характеризуют интенсивность биологической нагрузки на почву. Это — санитарно-показательные микроорганизмы: бактерии группы кишечной палочки (общие колиформные бактерии) и энтерококки. В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень велика и, как следствие, высоки индексы санитарно-показательных микроорганизмов, что наряду с санитарно-химическими показателями (динамика аммиака и нитратов, санитарное число) свидетельствует о неблагополучии и создании повышенного риска инфицирования. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает наличие высокого индекса БГКП при низких титрах нитрификаторов, термофилов, а также относительно высокое содержание вегетативных форм C. perfringens. Обнаружение энтерококков всегда свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, каковы бы ни были другие показатели.

2) Прямые санитарно-бактериологические показатели эпидемической опасности почвы — обнаружение возбудителей кишечных инфекций (патогенные энтеробактерии, энтеровирусы).

О возможности загрязнения почвы патогенными энтеробактериями свидетельствует индекс санитарно-показательных микроорганизмов БГКП (колиформ) и энтерококков 10 и более клеток/г почвы.

При необходимости углубленной оценки санитарного состояния почвы и способности ее к самоочищению исследуются показатели биологической активности почвы. Основными интегральными показателями биологической активности почвы являются: общая микробная численность (ОМЧ), клостридии, термофильные бактерии, грибы и актиномицеты, аммонификаторы, аэробные целлюлозные микроорганизмы и т.д.

Перечень показателей определяется целями исследования, природой и интенсивностью загрязнения, характером землепользования. Контроль загрязнения почв населенных пунктов проводится с учетом функциональных зон города. Места отбора проб предварительно отмечаются на картосхеме, отражающей структуру городского ландшафта. Отбор проб осуществляется согласно ГОСТ 17.4.4.01-83 "Общие требования к отбору проб почвы"; ГОСТ 17.4.4.02-84 "Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа". На территорию, подлежащую контролю, составляют описание с указанием адреса, точки отбора, общего рельефа микрорайона, расположения мест отбора и источников загрязнения, растительного покрова, характера землепользования, уровня грунтовых вод, типа почвы и других данных, необходимых для правильной оценки и трактовки результатов анализов образцов.

Отбор проб для бактериологического анализа проводится не менее 1 раза в год в местах возможного нахождения людей, животных, в местах загрязнения органическими отходами. При изучении динамики самоочищения почвы отбор проводят в течение первого месяца еженедельно, а затем ежемесячно в течение вегетационного периода до завершения активной фазы самоочищения.

Пробная площадка — часть исследуемой территории, характеризующаяся сходными условиями (рельефом, однородностью структуры почвы и растительного покрова, характером хозяйственного использования). Пробная площадка должна располагаться на типичном для изучаемой территории месте. На площади 100 кв. м закладывается одна пробная площадка размером 25 м. При неоднородности рельефа площадки выбирают по элементам рельефа.

Точечная проба — материал, взятый из одного места горизонта или одного слоя почвенного профиля, типичный для данного горизонта или слоя. Точечные пробы отбирают на пробной площадке из одного или нескольких слоев или горизонтов методом конверта. Точечные пробы отбирают ножом, шпателем или почвенным буром. Объединенную пробу составляют путем смешивания точечных проб, отобранных на одной пробной площадке.

Для бактериологического анализа с одной пробной площадки составляют 10 объединенных проб. Каждую объединенную пробу составляют из трех точечных проб массой от 200 до 250 г каждая, отобранных послойно с глубины от 0 до 5 см, от 5 см до 20 см.

Пробы почвы, предназначенные для бактериологического анализа, в целях предотвращения их вторичного загрязнения следует отбирать с соблюдением правил асептики: отбирают стерильными инструментами, перемешивают на стерильной поверхности, помещая в стерильную тару. Время от отбора проб до начала их исследования не должно превышать 1 суток.

Отобранные пробы необходимо пронумеровать и зарегистрировать в журнале, указав следующие данные: порядковый номер и место взятия пробы, рельеф местности, тип почвы, целевое назначение территории, вид загрязнения, дату отбора. Пробы должны иметь этикетку с указанием места и даты отбора пробы, номера почвенного разреза, почвенной разности, горизонта и глубины взятия пробы, фамилии исследователя.

Для приготовления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный, плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем, отбрасывают камни и прочие твердые предметы. Если проба почвы однородна, допускается тщательное перемешивание почвы в банке. Затем почву распределяют на листе ровным тонким слоем в форме квадрата. Диагоналями почву делят на 4 треугольника. Почву из двух противоположных треугольников отбрасывают, а оставшуюся вновь перемешивают, опять распределяют тонким слоем и делят диагоналями и так до тех пор, пока не останется примерно 0,5 кг почвы. Перед посевом почву просевают через сито диаметром 3 мм.

Образец почвы тщательно перемешивают и из него отбирают навески, величины которых выбираются исходя из предполагаемой степени загрязнения почвы и планируемых определений. Для учета почвенных микроорганизмов достаточно навески от 1 до 10 г. В навеску почвы добавляют небольшое количество стерильной водопроводной воды до получения пастообразного состояния почвы, растирая ее в течение 5 минут. Из суспензии делают раститровку. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде, добавляя к суспензии стерильную водопроводную воду в соотношении 1:9 к весу почвы (например: 1 г почвенной суспензии разводят в 9,0 мл стерильной водопроводной воды, 10 г почвы — в 90,0 мл воды и т.д.). Приготовленные разведения используются для посева на различные питательные среды, а также для учета численности микроорганизмов методом прямой микроскопии.

Бактерии группы кишечной палочки (БГКП) давно уже считаются удобными микробными индикаторами. Показатель "бактерии группы кишечных палочек" приведен в соответствие с принятой международной номенклатурой, который идентичен показателю "общие колиформные бактерии". К колиформам относятся грамотрицательные бактерии, имеющие форму палочек, способных развиваться в присутствии солей желчных кислот или других поверхностно-активных агентов с аналогичной способностью к подавлению роста и способных ферментировать лактозу при 35 — 37 °C с образованием кислоты, газа и альдегида, то есть на среде Эндо лактозоположительные колонии дают отпечаток в течение 24 — 48 ч. Они оксидазоотрицательные и не образуют спор. Бактерии группы кишечной палочки включают следующие роды: эшерихия, клебсиелла, энтеробактер, цитробактер и серрации.

При анализе почв, для которых предполагается невысокая степень фекального загрязнения, рекомендуется проводить определение титрационным методом и в качестве ускоренного метода для анализа слабозагрязненных почв рекомендуется использовать метод мембранной фильтрации (см.выше). При анализе загрязненных и сильно загрязненных почв, отобранных в местах интенсивного фекального загрязнения, рекомендуется проводить прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,2 мл на поверхность среды Эндо и немедленно равномерно распределять по поверхности шпателем. Посевы выращивают в термостате при 37 °C в течение 24 ч. Следующий этап исследований заключается в идентификации выросших микроорганизмов, который проводится аналогично определению общих колиформных бактерий титрационным методом и подсчету количества колиформных бактерий в 1 г почвы, для чего среднее число колиформных колоний, выросших на чашке, умножается на степень десятикратного разведения.

Кроме того, в почве проводят определение энтерококков и C.perfringens. Энтерококки — грамположительные, не образующие каталазу кокки, слегка вытянутые, с заостренными концами, располагающиеся в виде диплококков или коротких цепочек, реже одиночными кокками. Полиморфны. При росте на жидких средах (ЛПС — лактозо-пептонная среда, ЩЭС — щелочно-полимиксиновая среда) вызывают диффузное помутнение и образование осадка. Определение энтерококков также проводится титрационным и фильтрационным методом с использованием специальных сред.

Сульфитредуцирующие клостридии — спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при температуре 44°С в течение 16 — 18 ч. Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре (Вильсон-Блера) в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.

Определение общей численности почвенных микроорганизмов (ОМЧ). После титрования исследуемой почвы, из каждого разведения делают посев не менее двух объемов по 0,1 или 0,2 мл на поверхность почвенного агара, разлитого в стерильные чашки Петри, и равномерно шпателем растирают по всей поверхности чашки. Термостатирование засеянных чашек ведут при 28-30 °C в течение 72 ч. Учет результата: количество колоний на обеих чашках суммируют, делят на два и умножают на степень разведения. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г.

В почве также определяют количество актиномицетов и грибов.

Актиномицеты (греч. Actis — луч, mucos — гриб) — одноклеточные микроорганизмы, тело состоит из нетитрованного мицелия, который имеет вид ветвящихся тонких нитей. У актиномицетов, как и у бактерий, генетическую функцию выполняет нуклеоид. В нитях мицелия находятся зерна хроматина. Размножаются актиномицеты при помощи специальных органов плодоношения, путем прорастания спор, прикрепленных на спороносцах, простым делением, перешнурованием и почкованием. Актиномицеты — факультативные анаэробы, хорошо развиваются при 25 — 30 °C (оптимальная температура 35 — 37 °C) на плотных средах. Одни виды растут с образованием плотных гладких колоний, другие имеют складчатые, бугристые, корковидные, бархатистые, пушистые или мучнистые колонии, которые срастаются со средой и с трудом снимаются петлей. Актиномицеты могут быть бесцветными или пигментированными (синие, фиолетовые, красные, желтые, оранжевые, зеленые и т.д.), на плотных питательных средах часто образуют воздушный мицелий, на концах которого развиваются споры, придающие колониям определенный цвет.

Среди грибов встречаются сапрофиты и паразиты. Наибольшее значение для медицины представляют оомицеты (Oomycetus), аскомицеты (Ascomycetes), базидиомицеты (Basidiomycetes), дейтеромицеты (Deuteromycetes), форма клеток у молодых культур может быть круглая, яйцевидная или удлиненная, у зрелых клеток — грушевидная, булавовидная, веретенообразная, амебовидная. Основным структурным компонентом клеток грибов является мицелий, состоящий из разветвленных бесцветных нитей (гиф). У одних видов он состоит из нерасчлененной клетки (mucor), у других (высших грибов) он многоклеточный; у дрожжеподобных грибов (Candida) имеется псевдомицелий.

Установлена большая чувствительность почвенных актиномицетов и грибов к действию отдельных химических веществ по сравнению с почвенными споровыми и неспоровыми бактериями. Несомненно, что такая разбалансировка равновесия в почвенном микробиоценозе должна рассматриваться как отрицательное явление. Актиномицетам и грибам принадлежит большая роль в превращении широкого круга органических и минеральных веществ. Благодаря чрезвычайно выраженным антагонистическим и токсическим свойствам они оказывают большое влияние на формирование микробных почвенных биоценозов, являются продуцентами многих физиологических активных веществ: аминокислот, ферментов, витаминов.

Определение аммонификаторов в почве. Аммонифицирующие микроорганизмы принимают участие в расщеплении белковых соединений до аммиака. Их учитывают на мясо-пептонном агаре, а при необходимости на жидких пептонных средах (мясо-пептонный бульон, пептонная вода) с индикаторными бумажками, определяющими аммиак. Для определения выделяющегося аммиака над средой в пробирке подвешивают красную лакмусовую бумажку (при выделении аммиака она синеет) или полоски фильтровальной бумаги, пропитанные реактивом Круппа (от аммиака краснеют). При выращивании почвенных суспензий на мясо-пептонном агаре результаты выражают в КОЕ (колониеобразующих единицах) на 1 г почвы. При определении этого показателя в жидких средах определяют титр, индекс аммонифицирующих микроорганизмов по последней пробирке, в которой еще обнаруживается аммиак (на 10-е сутки) после термостатирования при температуре 25-30 °C.

Определение патогенных энтеробактерий родов Salmonella и Shigella в 1 г почвы. Сущность определения шигелл и сальмонелл заключается в использовании методов накопления патогенных бактерий в средах обогащения с последующим пересевом на плотные селективные и дифференциальные среды с последующим изучением биохимических свойств выделенных культур и их серологическую идентификацию по методике.

Используют не менее двух сред накопления из перечисленных: среду Мюллера Кауфмана, селенитовый бульон, магниевую среду, тетратионатовый бульон. Для сальмонелл используют любые две среды из четырех, для шигелл — селенитовую среду. Посевы инкубируют при 37°C в течение 18-24 часов, затем из каждого флакона делают высевы бактериологической петлей на чашки с плотными селективными средами: для сальмонелл — на висмут-сульфитный агар, для шигелл на бактоагар Плоскирева, среду Эндо. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37°C в течение 18 — 20 часов, а в случае отсутствия роста чашки с посевами оставляют еще на 24 часа в термостате. С каждой чашки снимают подозрительные на сальмонеллы и шигеллы колонии в пробирки с дифференциально-диагностическими средами. Окончательное определение биохимических и серологических свойств, био- и сероваров проводят по действующим МУ 17.04-23/307-84 "Микробиологическая диагностика заболеваний, вызываемых энтеробактериями".