5. Механизм, ингредиенты иммуноблоттинга

Иммуноблоттинг (ИБ) — высокочувстви­тельный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА. Смесь антигенов микроорганизма (родовых, видовых, групповых) разделяют на фракции, содержащие отдельные антигены с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле. Затем переносят его (блоттинг  от англ. blot, пятно) из геля на нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блоттами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченую ферментом. Образовавшийся на полоске комплексы антиген + антитело больно­го + антитело против Ig человека, меченое ферментом, выявляют до­бавлением субстрата и хромогена, изменяющих окраску под действием фермента. ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции, сифилисе, листериозе и других инфекциях.

6. Механизм, ингредиенты иммунной электронной микроскопии (иэм)

Иммунная электронная микроскопия  электронная микроскопия микробов, чаще вирусов, обработанных соответствующими антителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется «венчик» из антител, контрастированный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электронно-оптически плотными препаратами. То есть этот метод представляет собой непосредственную визуализацию взаимодействия антигена и антител методом электронной микроскопии.

Методически тест ИЭМ выполняется в следующей последовательности:

1. Материал, в котором предполагается наличие искомого вируса, смешивается и инкубируется со стандартной иммунной сывороткой.

2. Комплекс вирус-антитело осаждается центрифугированием в подходящих для него режимах.

3. К ресуспендированному осадку добавляется контрастирующее вещество, и полученный препарат исследуется под электронным микроскопом. В качестве данного вещества используется ферритин  белок, содержащий до 23 % железа, хорошо контрастирующий и поэтому применяющийся в качестве метки. После обработки мечеными АТ изучаемых объектов (вирусов, бактерий, срезов инфицированных клеток) они становятся электронноплотными и могут быть выявлены при электронной микроскопии.

В случае положительной реакции выявляются характерные агрегаты, состоящие из вирусных частиц, соединенных между собой мостиками из антител. Порог чувствительности ИЭМ невысок: надежное выявление вируса осуществимо, когда его концентрация в исходном материале составляет 10⁴10⁶ частиц в мл. Преимуществом метода является возможность оценивать не только исход серологической реакции, но и идентифицировать ее морфологический субстрат, т. е. определить форму и размер вирусных частиц. При наличии препаратов вируса с известным содержанием частиц ИЭМ может применяться и для количественного определения антител в сыворотках, для чего предложена специальная система учета интенсивности взаимодействия вируса и антител.

Современные тест-системы для серологической диагностики дают возможность определять не только суммарные антитела (антитела одной специфичности, принадлежащие к разным классам иммуноглобулинов), но и отдельно специфические IgG, IgM, IgA.

Таблица 30. Интерпретация результатов, основанных на определении комбинации IgG, IgM, IgA

Наличие класса антител			Интерпретация
IgG	IgM	IgA
- (+)	+	- (+)	Острая стадия заболевания
+	-	-	Перенесенная или текущая инфекция
- (+)	-	+	Текущая или хроническая инфекция

Рис. 28. Типичная динамика гуморального ответа на первичное и повторное инфицирование