Тема 3: Иммунологические реакции с мечеными ингредиентами: иммуноблоттинг, реакция иммунофлюоресценции, иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ.

Цель: знать технику постановки, механизм и учёт иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа (РИА), реакции иммунофлюоресценции (РИФ), иммуноблоттинга (ИБ), область применения и информативность указанных выше реакций; уметь учитывать иммуноферментный анализ, иммуноблотинг.

Задание на дом:

I. Вопросы для самоподготовки:

1. Особенности современных серологических реакций с использованием меток.

2. Механизм, цели применения реакции иммунофлюоресценции (РИФ), виды РИФ, ингредиенты.

3. Механизм, цели применения иммуноферментного анализа (ИФА), ингредиенты.

4. Механизм, ингредиенты радиоиммунного анализа (РИА).

5. Механизм, ингредиенты иммуноблоттинга.

6. Механизм, ингредиенты иммунной электронной микроскопии (ИЭМ).

II. Базовый текст

1. Особенности современных серологических реакций с использованием меток

1. Для проведения этих реакций используют метку (флюоресцеин, фермент или изотоп); которую соединяют (конъюгируют) с АГ или AT.

2. Эти серологические реакции происходят быстрее (экспресс) и качественнее.

3. Они являются высокочувствительными и возможна точная регистрация результатов специальными приборами.

4. Их проводят на стекле или в полистироловых планшетах с лунками.

Требования к меткам:

а) не изменять специфичность AT или АГ;

б) быстро и легко выявляться;

в) определяются количественно.

Основные виды меток:

а) светящиеся красители  флюорохромы. Такие серологические  реакции называют реакциями иммунной флюоресценции (РИФ);

б) ферменты  реакции иммуноферментного анализа (ИФА);

в) радиоактивные изотопы  реакции радиоиммунного анализа (РИА);

г) электронно-плотные белки  реакции иммунноэлектронной микроскопии (ИЭМ).

Меченые сыворотки выпускаются 2 разновидностей:

• антимикробные меченые сыворотки, содержащие антитела против определенных видов бактерий, вирусов, риккетсий, хламидий;

• антиглобулиновые меченые сыворотки, содержащие антитела против гамма-глобулинов крови человека или животных.

2. Механизм, цели применения реакции иммунофлюоресценции (риф), виды риф, ингредиенты

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод Кунса) является методом экспресс-диагностики для выявления антиге­нов микробов или определения антител. РИФ основана на использовании флюоресцеинизотиоцианата  ФИТЦ или других флюорохромов, химически связанных, конъюгированных с АТ. При этом меченые АТ сохраняют иммунологическую специфичность и вступают во взаимодействие со строго определенными корпускулярными АГ.

Различают две основные разновидности метода: прямой и непрямой.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные специфичными сыворотками с антителами, ме­ченными флюорохромами, способны светить­ся в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по пери­ферии клетки в виде каймы зеленого или желтого цвета.

Непрямой метод РНИФ заключается в вы­явлении комплекса антиген-антитело с по­мощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из исследуемых микробов обрабаты­вают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, от­мывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобули­новой (антикроличьей) сывороткой, мечен­ной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.