13. Механизм реакции пассивной гемагглютинации. Эритроцитарные диагностикумы

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка «зонтик». При отрицательной реакции эритроци­ты оседают в виде осадка с ровными краями «пуговка». Обычно в РНГА выявляют антитела с помощью антигенно­го эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбиро­ванными на них антигенами. Иногда приме­няют антительные эритроцитарные диагностикумы с адсорбироваными на эритроцитах антителами. Например, можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации — РОНГА).

III. План практической работы

1. Поставить и учесть опыт по определению титра лизоцима в слюне

В пробирку собирают 12 мл ротовой жидкости. Приготавливают разведение слюны 1:20, смешивая в пробирке 0,1 мл слюны и 1,9 мл изотонического раствора хлорида натрия. В 8 пробирок разливают по 2 мл изотонического раствора хлорида натрия. В первую пробирку вносят 2 мл ротовой жидкости, разведенной 1:20, перемешивают, переносят 2 мл жидкости в следующую пробирку. Процедуру титрования повторяют до седьмой пробирки включительно, из которой 2 мл жидкости сбрасывают в дезинфицирующий раствор. В восьмую пробирку (контроль мутности) по каплям вносят взвесь тест-микроба  Micrococcus lysodeicticus до появления минимально видимой глазом мутности. Найденное количество капель взвеси микроорганизмов вносят в каждую рабочую пробирку. Инкубируют пробирки в термостате при температуре 37ºС в течение 1 часа. Затем проводят учет, последовательно сравнивая контрольную пробирку с рабочими, начиная с первой. Реакцию считают положительной, если содержимое пробирки прозрачное и отрицательной, если  мутное. Титром лизоцима является наибольшее разведение слюны, вызвавшее лизис тест-микроба, то есть последнее её разведение, продемонстрировавшее положительный результат. Титр лизоцима в слюне здоровых людей составляет от 1:160 и выше.

2. Изучить методику постановки и учесть результаты опыта по определению активности фагоцитоза.

Образец крови смешивается в соотношении 1:4 с суспензией бактерий (стафилококк, кишечная палочка) или частицами латекса. Смесь инкубируется в течение 30 минут, затем из неё готовят мазок. Инкубирование смеси продолжают в течение еще полутора часов и приготавливают мазок. Мазки красят по Романовскому-Гимзе, затем микроскопируют с масляной иммерсией. В каждом мазке подсчитывают 100 нейтрофилов, среди них отдельно регистрируют клетки, фагоцитировавшие объекты. Количество поглощенных объектов также подсчитывают. Рассчитывают следующие показатели для 30-минутных и 120-минутных проб: фагоцитарный индекс и фагоцитарное число. Фагоцитарный индекс (ФИ)  это процент нейтрофилов, фагоцитировавших использованные объекты. Фагоцитарное число  среднее количество объектов, поглощенных одним фагоцитировавшим нейтрофилом. Показатели 30-минутной пробы характеризуют активность процесса поглощения, а 120-минутной пробы  переваривания объектов фагоцитоза. Индекс завершенности фагоцитоза рассчитывается как частное показателей фагоцитарных индексов 30- и 120-минутных проб. Нормальные значения показателей фагоцитоза для стафилококков и частиц латекса приведены в таблице.

Название показателя	30-минутная проба	120-минутная проба
ФИ, %	4090	2080
ФЧ, ед.	415	210
Индекс завершенности фагоцитоза	>1,0

3. Поставить и учесть РА на стекле для определения антигенного строения энтеропатогенных E.coli.

На обезжиренные предметные стекла наносят по капле диагностических агглютинирующих эшерихиозных сывороток О26, О55, О111 и изотонического раствора хлорида натрия. Стерильной бактериологической петлей в каждую каплю вносят и суспензируют биомассу выделенной накопленной чистой культуры E.coli со скошенного агара до появления легкой мутности. Предметные стекла покачивают и оценивают характер приготовленных смесей. Капля с изотоническим раствором хлорида натрия выглядит, как равномерно мутная суспензия и является отрицательным контролем. Другие капли оценивают, сравнивая с отрицательным контролем. Положительным результатом реакции считается образование белых мелких хлопьев в одной из приготовленных смесей.

4. Поставить и учесть развёрнутую реакцию агглютинации в диагностике бруцеллёза (реакция Райта).

В пяти рабочих пробирках готовят разведения исследуемой сыворотки от 1:50 до 1:800 с парными разведениями. Для этого в первую пробирку вносят 4,9 мл, в остальные четыре по 2,5 мл изотонического раствора хлорида натрия. В первую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки (получают разведение 1:50), перемешивают, а затем выполняют её титрование, перенося из предыдущей пробирки в последующую по 2,5 мл жидкости. Из пятой пробирки после перемешивания удаляют 2,5 мл жидкости в дезинфицирующий раствор. Во все рабочие пробирки добавляют по 0,5 мл бруцеллезного диагностикума. Готовят контроли: диагностикума, включающий 0,5 мл бруцеллезного диагностикума и 2,5 мл изотонического раствора хлорида натрия, и сыворотки, содержащий 2,5 мл сыворотки, разведенной 1/50, и 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Пробирки встряхивают и инкубируют при 37◦С в течение 2 часов, затем при комнатной температуре  1820 часов. Затем проводят учет результатов, начиная с контрольных пробирок. Положительным результат считается в случае образования рыхлого с фестончатыми краями осадка, покрывающего все дно пробирки (осадок в виде «зонтика»), отрицательным  при выпадении компактного с ровными краями осадка, занимающего центр пробирки (осадок в виде «пуговки»). Если в пробирке с контролем сыворотки жидкость прозрачная и в пробирке с контролем диагностикума наблюдается осадок в виде «пуговки» контроли считаются верными, а реакция специфичной. Затем оценивают результат в каждой рабочей пробирке. За титр сыворотки принимают максимальное её разведение, давшее положительный результат. Сравнивают титр антител в исследуемой сыворотке с диагностическим, который для реакции Райта составляет 1:200. Если титр антител в исследуемой сыворотке равен или превышает диагностический, то выдают положительное заключение, подтверждающее наличие заболевания.

5. Учесть РПГА с «парными» сыворотками в диагностике дизентерии.

Парные сыворотки титруют в двух рядах лунок плексигласового планшета от 1:50 до 1:800 с двукратными разведениями. В контрольную лунку добавляют равный объем изотонического раствора хлорида натрия. Во все лунки вносят одинаковые объемы эритроцитарного дизентерийного Зонне диагностикума. После инкубации при 37ºС в течение 2 часов проводят учет реакции. Критерии учета: положительный результат  склеивание эритроцитов и выпадение красного осадка в виде «зонтика», отрицательный  отсутствие гемагглютинации и образование осадка эритроцитов в виде «пуговки». Затем определяют титры специфических антител в обеих парных сыворотках и сравнивают их. Положительное заключение о наличии инфекционного заболевания делают, если в парных сыворотках наблюдается феномен нарастания титра специфических антител (если титр антител во второй сыворотке больше, чем в первой в четыре и более раз).