4. Зарисовать схему молекулярной гибридизации (мг)

Метод молекулярной гибридизации ДНК-ДНК используется для установления геномного родства в пределах рода и семейств микроорганизмов; РНК-ДНК на уровне порядка. Степень сходства или гомологичность последовательностей ДНК выражается процентом (%) гомологии и является мерой геномного родства микроорганизмов.

Схема точечной гибридизации

1. ДНК наиболее типичного штамма метится изотопом ³H тритием или ³²P фосфором

2. Фрагментация и денатурация меченой ДНК

3. Исследуемая ДНК денатурируется, но не фрагментируется и иммобилизуется на твердой фазе, например на гранулированном агаре, мембранных фильтрах (нитроцеллюлозные или нейлоновые)

4. Инкубация исследуемой ДНК с меченой ДНК в жидкой среде. При гомологии фрагменты меченой гибридизируются с исследуемой, т.е. формируется двунитчатая структура

5. Для повышения точности метода применяют обработку гибридов специфическим ферментом — нуклеазой S₁, которая способна «отсеивать» от гибридных дублексов непрореагировавшие одноцепочечные участки

6. Отделение гибридов с помощью гидроксиаппатита, т.е. отмывка гибридов от балластного материала

7. Подсчет радиактивности на счетчиках с определением % гомологии ДНК

Недостаток метода — короткий период полураспада фосфора и наличие специфического оборудования.

Блот-гибридизация

Метод выявления фрагментов ДНК, разделенных электрофорезом в агарозе. ДНК предварительно нарезается с помощью рестрикционных эндонуклеаз из суммарной ДНК. Перенос фрагментов ДНК на нитроцеллюлозные фильтры и обработка мечеными зондами.

Гибридизация in situ

Позволяет выявить нуклеиновые кислоты в инфицированных клетках. Клетки, после денатурации нуклеиновой кислоты, обрабатываются немечеными зондами, формирующими гибридные двунитчатые структуры, затем обработка меченой флюорохромом сывороткой к гибридомам. При наличии в материале незначительных количеств нуклеиновой кислоты вирусов применяется ПЦР.

5. Зарисовать схему постановки полимеразной цепной реакции (пцр) ( см. Базовый текст)

Схема цикла амплификации (многократного увеличения числа копий специфического

Фрагмента участка днк)

1. Денатурация (разрыв водородных связей и трансформация двухцепочечной ДНК в одноцепочечные) осуществляется при температуре 93-95ºC в течение 1-3 минут

2. Присоединение (отжиг) праймеров (олигонуклеоитидные генетические затравки) происходит комплементарно к соответствующим последовательностям специфического фрагмента на противоположных нитях ДНК. Температура отжига является специфической для каждой пары праймеров и располагается в интервале 50-65ºC. Точно рассчитанная и экспериментально проверенная величина температуры отжига праймеров является одной из определяющих специфичность реакции характеристик, исключающих присоединение праймеров к не полностью комплементарным последовательностям.

3. Комплементарное достраивание цепей ДНК (синтез фрагмента). Присоединившиеся праймеры формируют стартовые блоки, с которых начинается синтез ДНК. Комплементарное достраивание нитей ДНК всегда протекает только в направлении от 5'-конца к 3'- концу нити ДНК и происходит в противоположных друг другу направлениях. Образовавшиеся в первом цикле амплификации продукты синтеза служат матрицами для второго цикла амплификации, в результате которого, собственно, и происходит накопление искомого специфического фрагмента ДНК. Начиная с третьего цикла амплификации вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации — это и есть цепная реакция в ПЦР. Температура синтеза ДНК 72 ºC, время -3 мин.

Построение новых нитей ДНК из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ) осуществляет термостабильная ДНК-полимераза, т.н. Taq-полимераза в присутствии ионов магния и трис- HCl — буфера, которые создают необходимые условия для функционирования фермента.

В результате 30-45 циклов амплификации синтезируются 10⁸ копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агаровом (полиакриламидном) геле. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора, называемого термоциклером или амплификатором. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации.