5. Вирусологический метод. Культивирование вирусов

Лабораторные методы диагностики вирусных инфекций включают:

• вирусоскопический метод (табл. 37),

• вирусологический метод (культивирование, индикация и идентификацию возбудителя),

• серологический метод (обнаружение и определение титра противовирусных антител с помощью РТГА, РСК, ИФА и др.),

• экспресс-метод (реакция иммунофлюоресценции — РИФ, иммунная электронная микроскопия — ИЭМ, обнаружение элементарных телец, включений),

• молекулярно-генетический метод (обнаружение генетического материала с помощью ПЦР)

• биологический (применяют чувствительных лабораторных животных для культивирования, индикации и идентификации вирусов, изучение клинических симптомов и патоморфологических изменений.

Таблица 37. Особенности вирусоскопического метода диагностики

Вирусоскопический метод (время проведения 1-2 часа)
а) световая микроскопия	применяется для обнаружения крупных вирусов (оспы) в окраске по Морозову и внутриклеточных вирусных включений в окраске по Туревичу и Муромцеву. Применяется для экспресс-диагностики.
б) электронная микроскопия	дает возможность изучить ультраструктуру вириона
е) метод иммунной элек­тронной микроскопии, в основе которого лежит взаимодействие антител с вирусами при смешивании вируссодержащего материала со специфической сыворот­кой	в результате реакции образуется микропре­ципитаты, состоящие из вирусных частиц, покрытых своеобраз­ным «венчиком». Применяется для экспресс-диагностики.
г) иммунофлюоресцентный метод (прямой и не­прямой) с использованием флюоресцирующих сывороток	при положительной реакции в люминес­центном микроскопе наблюдается специ­фическое свечение. Применяется для экспресс-диагностики.

Вирусологический метод направлен на выделение и идентификацию вируса и является «золотым стандартом» в диагностике вирусных инфекций. Вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, в связи с этим, вирусологический метод имеет ряд принципиальных особенностей. Для проведения вирусологического метода диагностики требуется от 3-5 суток до 1 месяца. Схема вирусологического метода включает ряд последовательных этапов: 1) забор, транспорт и подготовка исследуемого материала, 2) культивирование, 3) индикация и 4) идентификация вирусов (табл. 38).

При заборе материала для исследований необходимо отбирать образцы с учетом локализации первичной репликации и ритма циркуляции возбудителя. Образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно, при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 суток) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при tºC -50ºC.

Таблица 38. Схема вирусологического метода

Подготовка исследуемого материала	Клинический материал обычно содержит смесь бактерий и вирусов, с целью их разделения проводят: центрифугирование антибактериальную деконтаминацию (антибиотики широкого спектра действия — бензилпенициллин, стрептомицин и др.) фильтрацию (бактериальные фильтры)
Культивирование вирусов	Вирусы размножаются только в живых клетках, соответственно используются следующие способы культивирования: куриные эмбрионы лабораторные животные культуры клеток (клеточные культуры) — первичные, полуперевиваемые, перевиваемые
Индикация вирусов	Цель данного этапа — выявление вируса. Вирусы являются ультрамикроскопическими микроорганизмами и для их визуализации используют специальные (опосредованные) методы: цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов (деструкция монослоя культуры клеток, формирование внутриклеточных включений, синцития и симпластов и др.) образования бляшек реакции гемагглютинации (РГА) гемадсорбции «цветной» реакции (подавление метаболической активности)
Идентификация вирусов	После обнаружения вируса необходимо определить вид и тип этого вируса. Существует два вида идентификации: Для сероидентификации вирусов используют Культивированные вирусы в культуре клеток, аллантоисную или амниотическую жидкость заражённого кури­ного эмбриона, и ставят реакции: а) торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА) б) связывания комплемен­та (РСК) в) нейтрализации (РН) г) иммуноферментного анализа (ИФА) д) реакция иммунофлюоресценции (РИФ) е) радиоиммунный анализ (РИА) Для генетической идентификации – ПЦР (полимеразная цепная реакция), МГ (молекулярная гибридизация)

Методы культивирования вирусов

1. Организм лабораторных животных

Лабораторных животных (взрослых или новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами (подкожно, внутримышечно, интраназально, интрацеребрально и др.) в зависимости от тропизма вирусов. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях весьма ограничено из-за видовой невосприимчивости животных ко многим вирусам человека, контаминации животных посторонними микробами, а также по экономическим и этическим соображениям.

2. Куриные эмбрионы

Куриные эмбрионы (5-12 дневные) заражают путем введения исследуемого материала в различные полости (аллантоисная, амниотическая, желточный мешок) и ткани зародыша. Таким образом, можно культивировать вирусы гриппа, герпеса, натуральной оспы и др. Достоинствами модели являются возможность накопления вирусов в больших количествах, отсутствие скрытых вирусных инфекций, доступность для любой лаборатории.

3. Клеточные культуры

Культуру клеток (тканей) наиболее часто применяют для культивирования вирусов. Метод культур клеток разработан в 50-х годах XX века Дж. Эндерсом и соавт., получившими за это открытие Нобелевскую премию. Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц и других биологических объектов, размножают вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде. Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и опухолевых тканей, обладающих по сравнению с нормальными клетками взрослого организма, более активной способностью к росту и размножению.