8.3. Спектроскопия

Как отмечалось, основной задачей современной биофизики является проникновение на самые глубокие молекулярные уровни структурной организации живого.

К таким биофизическим методам, которые дают прямую информацию о молекулярных процессах, протекающих в организме, можно отнести люминесцентную, инфракрасную и лазерную спектроскопию; а также термографические методы исследования.

Метод исследования фотобиологических процессов с помощью спектров называется адсорбционной спектрофотометрией. Спектры поглощения изучаются с помощью специальных приборов - спектрофотометров. В основе спектроскопии лежит зависимость фотобиологического процесса от длины волны D=f().

Если спектры изучаются с помощью спектрофотометра в инфракрасном свете, то сам метод называется ИК-спектроскопией. Если используется индуцированное излучение, то лазерная спектроскопия. Если же спектры излучаются при люминесценции, то метод называется люминесцентной спектроскопией. Прибор, используемый при спектроскопии, называется спектрофотометром (рис.8.4). Луч света от источника 1 падает в монохроматор 2 - прибор, дающий излучение строго определенной длины волны. Далее монохроматический луч проходит через кюветы 3, содержащие исследуемое вещество и далее в ФЭУ (фотоэлектроумножитель 4), после которого в регистрирующее устройство 5, отрегулированное по акустической плотности.

Спектроскопический метод позволяет выяснить, какое вещество ответственно в данном процессе за поглощение света. Это достигается в результате сравнения спектров исследуемого вещества со спектром известных веществ. По положению максимума на шкале длин волн можно определить длину волны света, преимущественно поглощаемого этим веществом. Зная длину волны поглощенного света, определяют энергию поглощения квантов. По величине энергии узнают переходы молекул из одного энергетического состояния в другое и рассчитывают расположение электронов и колебательных энергетических уровней молекулы.

Рис. 8.4. Схема спектрофотометра

При так называемой адсорбционной ИК-спектроскопии используют два импульса. Один, имеющий достаточную мощность, называют возбуждением. Другой, более слабый, называют зондирующим.

Методика заключается в следующем: фокусируется луч инфракрасного или лазерного излучения на выбранную с помощью микроскопа маленькую область мишени. Используется такая температура, при которой возможен спектральный анализ, то есть можно получить спектр поглощения. Полученный сплошной спектр фотографируется с помощью спектрометра. Используется поточная методика in vitra, то есть вне организма. Берется биологическая ткань размером 50 мм и весом 10^-7 г, облучается лазерным лучом длиной волны 693 Å; N=30 кДж.

В данном случае под действием лазерного излучения происходит испарение вещества. Получают атомный спектр испаряющегося материала, который фотографируют уже на спектрографе (спектральный анализ для лазерных лучей). Обычно используются ударные волны, которые распространяются со звуковыми скоростями и используются для регистрации спектров поглощения.