5.4. Регистрация биопотенциалов

Развитие микрометодов позволило получить точные данные о тонком строении различных тканей организма и усовершенствовать методики изучения их биофизических характеристик. В частности это относится к регистрации мембранного потенциала. Для этих целей микроэлектрод может быть введен внутрь клетки через прокол в ее мембране. Это позволит изучить не только закономерности возникновения и распространения возбуждения в клетке, но и исследовать физико-химические свойства мембраны, вскрыть закономерности прямого раздражения клетки. Для этого используют неполяризующиеся микроэлектроды, которые подразделяются на металлические и жидкостные (капиллярные), наполненные раствором электролита. Металлические, как правило, покрыты слоем изоляции. Основное преимущество жидкостных микроэлектродов заключается в следующем: заполняющий их электролит создает надежный контакт между плазмой клетки или межклеточной жидкостью и металлическим проводником, идущим на выход усилителя. Для того чтобы убрать электродвижущую силу (ЭДС) поляризации между электролитом и металлом, можно ввести неполяризующийся мостик (в простейшем случае используется система агар-агарового мостика с KCl).

Металлические микроэлектроды могут иметь относительно низкое омическое сопротивление. Они более пригодны, чем жидкостные, для длительных экспериментов, обладают большей механической прочностью и гибкостью. Основной недостаток - возникновение ЭДС поляризации, что приводит к нагреванию биологической жидкости и ее закипанию.

При внутриклеточной регистрации потенциалов, связанной с проколом микроэлектродом клеточной мембраны, диаметр кончика микроэлектрода должен быть менее 0,5 мкм. Такой микроэлектрод должен иметь достаточную механическую прочность, чтобы не сломаться при прохождении через ткань. Диаметр кончика подобных микроэлектродов лежит за пределами разрешающей способности обычного оптического микроскопа. Поэтому микроэлектроды с d ≤ 0,5 мкм называют ультраэлектродами.

Изготовление микроэлектродов. Первый этап изготовления заключается в том, что более толстую стеклянную трубку, нагревая на пламени горелки, вытягивают в капилляр. Внутренний диаметр трубки должен составлять 2/3 наружного диаметра. Растягивание производят ступенчато: сначала до диаметра в 0,3 мкм, а затем быстро, при минимальном нагревании, до 0,2…0,1 мкм. При быстром растяжении после умеренного нагрева получают более тонкостенные капилляры. При медленном растяжении значительно размягченной трубки получают более толстостенные капилляры. Степень размягчения стекла оценивают по степени изгибания трубки во время нагрева и ее цвету.

Для изготовления микроэлектродов с диаметром в доли микрона используют стекла пирекс, которые имеют достаточную механическую прочность, высокое удельное сопротивление и химический нейтралитет. Диэлектрическая постоянная пирекса в несколько раз выше, чем у натриевого стекла.

Заполнение микроэлектродов. В зависимости от поставленных задач, перед проведением исследования применяют различные электролиты для заполнения жидкостных микроэлектродов. Для внутриклеточной регистрации микроэлектроды заполняют изотоническим раствором KCl, а также 1…3%-ым раствором КСl. Для удлинения срока хранения микроэлектродов их надо содержать в темноте при t=5 °C. Для заполнения микроэлектрода последний погружается кончиком в электролит, который кипятят до тех пор, пока весь воздух в капилляре не будет замещен жидкостью.

Микроэлектрод должен быть неполяризующимся, стабильность которого достигается в том случае, когда хлорированное серебро контактирует не непосредственно с электролитом микроэлектрода, а через агар-агаровый мостик. Присоединение микроэлектрода к капилляру, содержащему агар-агар на электролите, может осуществляться посредством резиновой трубки, заполненной для надежного контакта электролитом.

Для приготовления хлорированного серебра лучше всего использовать химически чистую серебряную проволоку диаметром около 1 мм. После тщательной очистки и промывки, участок проволоки, подлежащий введению в микроэлектрод и иногда скручиваемый спиралью, погружают в 0,75 N раствор химически чистой соляной кислоты. На проволоку подается анод постоянного тока. Электрический ток пропускают в течение 3–5 часов. Плотность электрического тока должна составлять приблизительно ≈5 мА/см² поверхности проволоки, погруженной в раствор. При этом получается гладкое и равномерное покрытие проволоки хлористым серебром. Необходимо производить одновременное хлорирование двух серебряных проволок, одна из которых предназначается для микроэлектрода, а другая – для парного ему референтного (индифферентного) неполяризующегося электрода. Катодом при хлорировании служит специальная серебряная проволока или пластинка. После хлорирования проволоку несколько раз тщательно промывают в дистиллированной воде, затем помещают в проточную воду для удаления следов НС1, после чего снова промывают в дистиллированной воде.

После изготовления оба хлорированных серебряных электрода помещают на несколько дней в раствор Рингера. При этом начальная разница в потенциале снижается или даже может совсем исчезнуть.

Следует иметь в виду, что хлористое серебро растворяется в концентрированном растворе КС1. Поэтому не следует допускать прямого контакта электрода с КС1.

Агар-агар, предназначенный для приготовления высококачественного неполяризующегося микроэлектрода должен пройти следующую обработку. Кусочки сухого агар-агара кладут в мешочек из чистой ткани и помещают в дистиллированную воду на 12 или более часов для набухания. Затем в агар-агар вводят платиновый электрод, а другой платиновый электрод помещают снаружи около мешочка. Через электроды пропускают постоянный электрический ток напряжением 110В в течение 5 часов. Затем ток пропускают еще раз в течение 5 часов в обратном направлении. При этом из агар-агара будут полностью удалены катионы и анионы неорганических примесей (Мещерский К.Т., I960).

Микроэлектроды, заполненные трехмолярным раствором КСl, имеют значительный (до 30…70 мВ) собственный потенциал, возникающий при погружении их кончиков в раствор электролита. Потенциал микроэлектрода имеет отрицательный знак и обычно тем выше, чем больше различие в концентрации внешнего и внутреннего электролита и омическое сопротивление микроэлектрода. Таким образом, при измерении мембранного потенциала обычно допускается значительная ошибка, если не учитывается потенциал кончика микроэлектрода.

Хорошо показала себя методика, в основе которой лежит метод прокалывания движущихся под давлением клеток крови с последующим насаживанием их в виде "бубликов" на острие микроэлектрода.

Само устройство для введения микроэлектрода в клетку создано в виде замкнутой системы трубопроводов, выполненных из индифферентных материалов (рис. 5.6).

Рис. 5.6. Устройство для ввода микроэлектрода в клетку

Трубопроводы размещаются непосредственно в корпусе устройства и содержат резервную камеру с микроотверстием для воздуха. Резервная камера через пропускной клапан соединена с камерой давления с помощью трубопровода. Пропускной клапан не позволяет исследуемой среде возвращаться обратно в резервную камеру при создании давления в системе. Камера давления выполнена в виде цилиндра, в верхней части которого установлен штуцер для подключения пневмоподающего устройства. Снизу камера давления имеет герметическую пробку, которая обеспечивает доступ при промывке и стерилизации камеры давления. На уровне герметической пробки камера давления имеет отверстия, переходящие в трубку диаметром 1 – 2 мм, в которой по центру неподвижно установлен микроэлектрод. Микроэлектрод закрепляется в пробке, герметично закрывающей горизонтальную трубку. Удаленный от камеры давления конец трубки соединен трубопроводом с резервной камерой.

Наличие замкнутой системы позволяет вести исследования среды при неоднократном ее использовании, так как, поступающая из резервной камеры в камеру давления, исследуемая среда под давлением омывает микроэлектрод, и клетки крови автоматически насаживаются на его острие, при условии, если диаметр его значительно меньше диаметра исследуемых клеток. Среда через трубопровод вновь поступает в резервную камеру и может быть использована повторно. Все устройство работает следующим образом.

При определении биопотенциала покоя клеточных мембран подвижных клеток, например эритроцитов, берут необходимое количество крови с 0,1 % цитрата натрия для предупреждения ее свертывания. Полученную исследуемую среду помещают в резервную камеру, из которой через открытый пропускной клапан исследуемая среда перемещается в камеру давления до полного ее заполнения. Перепускной клапан закрывают и через штуцер нагнетают воздух, под действием которого исследуемая среда через трубку поступает по трубопроводу в камеру, омывая при этом микроэлектрод, на который нанизываются клетки, передавая свой биопотенциал на усиливающую и регистрирующую аппаратуру.

Отрицательный электрод в камеру давления пропущен через пробку–винт. Как уже отмечалось, при полном перемещении исследуемой среды цикл повторяют нужное количество раз.

Устройство для автоматического введения микроэлектрода в клетку позволяет:

1) вводить микроэлектрод без утомительных манипуляций в любые клетки, в том числе и клетки крови;

2) изучить изменение биопотенциала покоя различных клеток по степени их травмирования микроэлектродом.

В качестве регистрирующей аппаратуры при проведении исследований можно использовать интегрирующий цифровой вольтметр постоянного тока который пригоден для измерения напряжения постоянного тока, в широком диапазоне напряжений от 10 мкВ до 1000 в с погрешностью ± 0,05%. Измеряемые значения отсчитываются по цифровому табло, прибор работает с автоматическим и ручным запусками; чувствительность прибора 10 мкВ.