4.5. Физико-химические методы исследования клеточных мембран

Современное представление о строении биологических мембран связано с использованием физико-химических методов исследования. Большую роль в строении биологических мембран сыграла электронная микроскопия.

4.5.1. Электронная микроскопия

Свет обладает дуализмом. Наряду с электромагнитной теорией, свет представляет собой поток частиц - фотонов. Фотон - элементарная частица, обладающая волновыми свойствами:

; ; , (4.3)

где h=6,63·10^-34 Дж·с - постоянная Планка;

ν- частота светового пучка, с^-1;

λ- длина волны, м.

Де-Бройль Л. предположил, что все частицы обладают волновыми свойствами:

, или . (4.4)

Волновые свойства частиц были использованы для получения увеличенного изображения предмета. Как известно, предел разрешения оптического микроскопа определяется предельным значением длины волны света, воспринимаемого глазом. Для оптического микроскопа

; , или , (4.5)

где Z - разрешающая способность микроскопа, то есть способность видеть две ближайшие точки предмета без искажения;

- апертура;

n - показатель преломления объектива;

-апертурный угол.

Таким образом, световой микроскоп не позволяет рассмотреть детали объекта меньше половины длины волны света, то есть около 200 нм. Следовательно, в оптическом микроскопе можно рассмотреть только отдельные клетки, то есть он совершенно не пригоден для изучения биологических мембран. Оптическая способность Z, как известно, ограничена явлением дифракции. Поэтому, чем меньше длина волны, по сравнению с размерами исследуемого объекта, тем меньше искажение ( ).

Обратимся к электронному микроскопу. Пусть электрон массой m и зарядом e, вылетающий из электронной пушки со скоростью v, имеет энергию

, (4.6)

отсюда .

Длина волны Де-Бройля будет

, или . (4.7)

Для получения пучка электронов, который можно зафиксировать на экране осциллографа, необходимо U=1 кВ, тогда , что соответствует рентгеновским лучам. Это уже позволяет рассмотреть отдельные детали клеточных мембран. Недостатком электронной микроскопии является деформация объекта в процессе исследования, так как производится обезвоживание, закрепление ультратонких сред и т.д. С помощью электронной микроскопии удалось: 1) получить изображение биологических мембран; 2) рассчитать толщину мембраны.

Было получено трехслойное строение мембраны. Толщина ее, по расчетам многих авторов, 2…3 нм. Значительно изменилось представление о строении мембран. Была отвергнута "бутербродная модель", просуществовавшая более 40 лет. Новая информация о строении биологических мембран была получена с помощью метода, который называется "замораживание-скол-травление" и состоит в следующем:

1) клетку охлаждают до очень низкой температуры в жидком азоте;

2) охлаждение производят с большой скоростью (100 °C в секунду);

3) клетку раскалывают специальным ножом и помещают в вакууме. Лед возгоняется, освобождая поверхность скола (этот процесс называется травлением). После травления получают отпечаток сколотой поверхности;

4) скол фотографируют в электронном микроскопе. Таким образом можно фиксировать внутреннее строение мембраны.

Было доказано, что структурную основу биологической мембраны составляет двойной слой фосфолипидов, который инкрустирован поверхностными и интегральными белками. Молекула фосфолипидов представляет собой цилиндр, 1/3 которого гидрофильна (полярная головка), то есть может притягивать молекулы воды и образовывать водородные связи, 2/3 - гидрофобны. Белки, входящие в состав мембран, также весьма разнообразны. В их состав входит от 100 до 500 аминокислот. Белки занимают 75…80% поверхности мембран. Белковые молекулы покрывают мембрану с обеих сторон, придавая ей эластичность и устойчивость к механическим повреждениям. Как уже говорилось, принято разделять белки на интегральные и периферические. Интегральные белки имеют на поверхности большие гидрофильные участки и располагаются внутри мембран. Периферические находятся на ее поверхности. Доказано, что они могут менять степень погружения в липидный слой и перемещаться в плоскости мембраны (рис. 4.3).

Рис. 4.3. Строение клеточной мембраны: а - интегральные белки; б - периферические белки

В тех местах, где интегральные белки пронизывают бислой, могут образовываться каналы (поры). Диаметр каналов 0,35…0,8 нм. В эритроцитах вся площадь каналов составляет 0,06% от поверхности мембраны. Полярная группа белков в каналах направлена в сторону отверстия канала, а неполярные вступают во взаимодействие с молекулами липидов. Таким образом, стенки каналов обладают электрическими зарядами. Это играет большую роль при прохождении ионов через канал. Разными физическими методами доказано, что длина липидных молекул ≈3 нм (это фиксировали с помощью электронного микроскопа) толщина бислоя 1 нм. Таким образом, толщина всей мембраны ≈ 8…10 нм. На одну молекулу белка приходится 75-90 молекул липидов.