2.2. Медиаторная специфичность нейрона и идентификация медиатора

Медиаторная специфичность нейрона выражается комплексом признаков, определяемых природой самого медиатора.

В клетках разной специфичности неизбежно различны ферментные системы, ведущие синтез медиатора. Так, в нейронах, секретирующих ацетилхолин, высока активность холинацетилазы, чего нет, допустим, в нейронах, секретирующих норадреналин и дофамин. Клетки двух последних типов, хотя и очень близки в ряде отношений, различаются между собой тем, что в первых (норадренергических) имеется фермент дофамин-бета-оксидаза, не нужный вторым (дофаминергическим).

Различны, в зависимости от природы медиатора, и вещества, из которых построены секреторные органеллы цитоплазмы нейронов. Так, в состав секреторных гранул в нервных клетках, выделяющих катехоламины, входят белки хромогранины, а в нейронах, выделяющих физиологически активные октапептиды, — белки нейрофизины.

Различия в химическом составе медиатора и сопутствующих ему макромолекул находят проявление в строении некоторых структур цитоплазмы, в частности, секреторных пузырьков и гранул, которые неодинаковы по своим морфологическим характеристикам в разных нейронах.

Наконец, неодинаковы системы избирательного накопления медиаторных веществ из внеклеточной среды. Этими системами обеспечивается реутилизация выделившегося из клетки медиатора, в связи с чем они работают с высокой специфичностью.

Благодаря тому что каждый тип медиаторной специфичности выражается совокупностью характерных свойств химизма и, отчасти, строения, работа по установлению типа специфичности у исследуемых нейронов и синапсов в значительной степени облегчается. Её, в принципе, можно вести, используя широкий арсенал методов, которые всё больше становятся реально доступными; в их числе цитохимическое обнаружение самих медиаторных веществ, определение активности ферментов синтеза медиаторов, иммунохимическая локализация этих ферментов или специфических структурных белков, ультрамикроскопическое исследование секреторных органелл, изучение систем захвата экзогенных медиаторов или их аналогов, и т. д. Применение каждого из этих приёмов связано, конечно, со своими трудностями, но всё же на этой основе можно идентифицировать тип нейрона или синапса.

Значительно труднее работа по химической идентификации неизвестных медиаторов. Вопрос о критериях, которые при этом должны выполняться, неоднократно обсуждался в литературе, и разными авторами публиковались разные списки таких критериев, Р. Верман справедливо заметил недавно, что для отождествления передатчика достаточно, чтобы были удовлетворены всего лишь два критерия: критерий накопляемости и критерий идентичности действия. Смысл первого заключается в том, что вещество, предполагаемое медиатором, должно при физиологических для данного синапса условиях выделяться из пресинаптической структуры в ответ на пресинаптическое раздражение в количестве, соответствующем количеству стимулов. По второму критерию, предполагаемый медиатор должен действовать на постсинаптическую структуру, используя те же молекулярные механизмы, которые обеспечивают эффект самого естественного передатчика [340].

Длинные списки критериев возникли, по мнению Вермана, потому, что достаточность двух указанных критериев не всегда осознается, и главным образом потому, что применить эти два критерия совсем не просто.

В последние годы выяснилось, что некоторые критерии, которые до середины 60-х годов считались чуть ли ни главными, нужно признать ошибочными. Исторически случилось так, что в первые десятилетия изучения медиаторного процесса объектом исследований служили периферические холинергические соединения позвоночных (окончания блуждающего нерва на сердце и моторных волокон на скелетных мышцах). В ходе этих исследований развились общие представления о химическом синапсе, в том числе убеждение, что химический синапс должен быть обеспечен ферментом, инактивирующим передатчик. Из «критерия инактивирующего энзима» вытекал как следствие ещё один критерий: эффект вещества, предполагаемого медиатором, как и эффект раздражения пресинаптических волокон, должен усиливаться при применении фармакологических агентов, ингибирующих указанный фермент. Эти критерии следует признать неудовлетворительными. Ярче всего их ограниченность выявилась при изучении синапсов, использующих в качестве медиатора иные, чем ацетилхолин, вещества. Как теперь считают, синаптическое действие катехоламинов прекращается главным образом благодаря обратному захвату их нервным окончанием из синаптической щели. Сходный механизм предполагается для синапсов, передачу в которых осуществляет глицин, гамма-аминомасляная кислота и некоторые другие медиаторы [см. 194]. Прекращение действия синаптического серотонина некоторые авторы связывают с десенситизацией рецепторов к передатчику [168], однако на беспозвоночных и для серотонинергических волокон показан избирательный захват медиатора [266].

Сравнительное изучение холинергических соединений также привело к пересмотру существовавшего ранее представления об обязательном участии синаптической холинэстеразы в медиаторном процессе, осуществляемом ацетилхолином. Синаптическое действие этого передатчика может быть остановлено, по-видимому, по крайней мере тремя разными способами: диффузией из синаптической щели, инактивацией холинорецептора и, наконец, энзиматической инактивацией самого ацетилхолина. Это разнообразие механизмов, с одной стороны, выражает собой процесс эволюционного совершенствования синапсов, а с другой, способ, посредством которого определяются функциональные параметры передачи. Подробнее этот вопрос рассмотрен нами, совместно с Турпаевым, в специальных статьях [65, 285, 317]; отчасти, об этом будет идти речь ниже в связи с обсуждением вопроса об эволюции нервных клеток (7.3.).

С учетом данных, не укладывающихся в существовавшую ранее схему медиаторного процесса, вопрос о критериях идентификации медиатора рассмотрен в нескольких работах [337, 6, 242, 337, 339, 340]. В общем, мнения их авторов во многом совпадают. Признается ценным для периферических окончаний один из старых критериев: при раздражении пресинаптических волокон предполагаемый передатчик должен обнаруживаться во внеклеточной среде в области синапса. Хотя практические трудности ограничивают приложимость этого критерия к синапсам ЦНС, иногда удается их преодолевать, применяя высокочувствительные методы обнаружения малых количеств медиатора.

Несколько критериев выдвигаются в качестве более универсальных. Во-первых, вещество, предполагаемое медиатором, должно в достаточных количествах иметься в пресинаптическом нейроне, с преимущественной локализацией в окончаниях аксона. Во-вторых, здесь же должна присутствовать энзиматическая система для синтеза этого вещества или для обеспечения окончаний медиатором каким-то иным способом. В-третьих, постсинаптическая мембрана должна обладать специфической чувствительностью к предполагаемому медиатору. В-четвёртых, при нанесении предполагаемого медиатора на постсинаптическую структуру он должен воспроизвести все эффекты синаптическо-го действия. В-пятых, фармакологические агенты, влияющие на постсинаптические эффекты естественного передатчика, должны сходным образом влиять на эффекты предполагаемого медиатора при его искусственном нанесении на постсинаптическую структуру.

Почти все эти критерии могут приниматься с известными оговорками, и к ним нельзя относиться некритически. Так, нет полной уверенности в том, что специфические рецепторы, на которые действует медиатор, должны обязательно находиться на постсинаптической мембране: между медиаторами и гормонами нет строгой границы, а среди гормонов известны такие, которые взаимодействуют с внутриклеточными рецепторными структурами.

Больше всего оговорок высказано по поводу четвёртого и пятого из упомянутых критериев. Здесь исследователь встречается с некоторыми осложнениями принципиального характера. Техника многоканальных микроэлектродов, используемая в таких экспериментах, позволяет апплицировать испытуемое вещество на тело нейрона, внутрь которого введен отводящий микроэлектрод. Синаптические же окончания и сами рецепторы к медиатору нередко располагаются на значительном расстоянии от тела нейрона — например, на удалённых частях дендритов. В таких ситуациях испытуемое вещество, в точности идентичное медиатору, не будет давать эффекта, вполне идентичного эффекту раздражения пресинаптических волокон: например, неодинаковыми окажутся потенциалы равновесия. Специальные исследования этих трудностей показывают, что они преодолимы, но важно не упускать их из вида.

Мак-Леннан в последнем издании своей книги «Синаптическая передача» [242] предлагает включить в число критериев развитие денервационного повышения чувствительности к веществу — кандидату в передатчики. В самом деле, в некоторых синаптических структурах чувствительность к медиатору повышается после денервации на несколько порядков. Но нельзя забывать о том, что известны и противоположные ситуации. Так, клетки членистоногих вообще теряют чувствительность к гамма-аминомасляной кислоте после перерезки тормозных волокон, выделяющих на них этот медиатор; рецепторы к медиатору снова восстанавливаются после регенерации иннервирующих волокон [см. ссылки в 279].

Применение указанных критериев должно быть комплексным, только в этом случае можно с уверенностью решать вопрос о медиаторной роли того или иного вещества. Поучительна в этом отношении история изучения передачи в окончаниях симпатических нервных волокон. Сейчас общепризнанно, что передачу в них осуществляет, по крайней мере у теплокровных, норадреналин. Но ещё в начале 60-х годов, несмотря на наличие убедительных фактов, продолжались споры о месте, из которого высвобождается норадреналин при возбуждении симпатических нервов: нельзя было доказательно утверждать, что амин изливается из самих нервных окончаний, а не из внешней по отношению к ним структуры, например, из хромаффинных клеток. Как подчеркнул известный шведский фармаколог А. Карлссон, недостающий критерий удалось выполнить лишь благодаря появлению гистохимического метода Фалька и Хилларпа [111].

Вообще, нужно отметить, что если ещё не так давно вопросом об идентификации медиаторов и установлении типов медиа-торной специфичности интересовались только физиологи, то сейчас в решении этих вопросов очень велика стала роль информации, получаемой с помощью морфологических [см. 180] и микрохимических методов исследования [162, 169, 240 — 241а, 259, 263, 330, 331 и др.], и эти методические подходы к медиаторным проблемам представляются сегодня наиболее перспективными.