2. Основы биотехнологии производства гамма – глобулинов

В предупреждении инфекционных болезней и лечении больных животных большую роль играют глобулиновые препараты. К ним относятся ''неспецифический'' (нормальный) гамма-глобулин, полученный из сыворотки крови здоровых животных, а также иммунные глобулины, выделенные из гипериммунных сывороток или сывороток переболевших животных (сыворотка животных-реконвалисцентов).

Огромное значение имеют глобулиновые препараты для сохранения новорожденного молодняка с/х животных.

Начиная с 1946 г., после того, как была установлена высокая эффективность гамма-глобулина при кори, в нашей стране стал выпускаться гамма-глобулин для медицинских целей. Медицинская промышленность, выпускала гамма-глобулин, полученный как из сыворотки крови человека, так и из сыворотки крови иммунизированных животных.

В конце 50-х годов было начато изучение профилактического и лечебного действия гамма-глобулинов в ветеринарии.

С 1962 г, на основании экспериментальных работ профессора Харьковского зооветеринарного института И.И. Лукашева и по его предложению, в нашей стране, впервые, на Орловской биофабрике было организовано производство гамма-глобулина против болезни Ауески из гипериммунной сыворотки.

Существует целый ряд комбинированных методов получения гамма-глобулиновых препаратов. Однако из большого числа предложенных методов получения гамма-глобулинов производственное значение имеют не многие. К ним относятся: солевой, спиртовой, риваноловый и спиртово-хлороформный.

2.1. Общие сведения о гамма-глобулинах

Кровь состоит из жидкой части - плазмы и форменных элементов: эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов.

Плазма крови, лишенная белка фибриногена, называется сывороткой крови. Известно около 100 белковых компонентов плазмы.

Условно их можно разделить на три группы:

- альбумины

- глобулины

- фибриноген.

Белки плазмы, которые остались после удаления фибриногена, называются сывороточными белками.

Глобулины сыворотки крови делятся на три фракции: α, β, γ- глобулины. Каждая фракция, в свою очередь, делится на подфракции. Разделение основано на их различной электрофоретической подвижности.

Гамма-глобулин (γ-глобулин) представляет собой белковую фракцию сыворотки крови, которая выполняет функцию защитных антител в организме и обладает наименьшей электрофоретической подвижностью.

Впервые эту фракцию выделил из сыворотки крови А.Тизелиус в 1937 году и назвал её гамма - глобулином.

Гамма-глобулины не являются однородным сывороточным белком. Методом электрофореза на бумаге они разделяется на гамма 1- и гамма 2 - глобулины, а наиболее тонкими методами - на значительно большее число фракций. Из белковых фракций сыворотки крови гамма глобулиновая является самой неоднородной (имеется более 16 подфракций). Однако все подфракции гамма-глобулина очень близки по физико-химическим свойствам и электрофоретической подвижности (по данным Н.В. Клениной, 1971).

Чистые препараты гамма-глобулина не должны содержать протеины с электрофоретической подвижностью большей, чем 2,8∙10^-5 в вероналовом буфере при рН – 8.

Гамма-глобулины (гамма; 7S гамма; 6,6S гамма; гамма 2; гамма SS) составляют основную массу иммуноглобулинов. В сыворотке крови человека на долю гамма-глобулина приходится 70-75 % иммуноглобулинов.

Было установлено, что гамма-глобулин человека имеет константу седиментации S20, равную 7,2. Внутренняя вязкость равна 0,06, а парциальный удельный объём 0,739, отсюда был вычислен молекулярный вес гамма-глобулина, который оказался равным 150000 (У.70 д).

По данным Светберга и Петерсона (1976) этот вес составляет 176000. Было уточнено, что длина макромолекулы гамма-глобулина при исследовании методом рассеяния рентгеновых лучей равна 230-240 А, а по оси поперечного сечения –57 и 19 А.

Изоэлектрические точки (т.е. концентрация водородных ионов (реакция среды) гамма 1- и гамма 2- глобулина человека находятся при рН 6,5 и 7,3; изоэлектрические сыворотки белка – при рН 5,85 и 7,35 (Гауровитц,1963).

Изоэлектрическая точка общей гамма-глобулиновой фракции лежит в пределах рН-6,8-7,3 (Афонский,1960) или рН-6,3-8,3 (Фердман,

1962).

По форме частиц гамма-глобулин относится к глобулярным белкам, форма которых приближается к сферической или палочковидной.

Глобулиновые белки растворимы в воде и солевых растворах. Одни фракции глобулинов нерастворимы в чистой воде и называются эвглобулинами, другие же наоборот, хорошо растворяются в чистой воде и называются псевдоглобулинами.

Разграничить эти компоненты по растворимости очень трудно. Так, при диализе гамма-глобулина против дистиллированной воды, в осадок выпадает эвглобулиновая фракция, псевдоглобулиновая остаётся в растворе. Однако, дальнейший диализ псевдоглобулина приводит к дополнительному выпадению в осадок эвглобулиновой фракции (Хаджес, 1985).

Макромолекулы гамма-глобулинов довольно гибкие. Было отмечено, что характеристическая вязкость и оптическая активность гамма- глобулинов в значительной степени зависит от рН среды.

Было установлено, что оптимум устойчивости гамма-глобулинов в растворах находится при значениях рН, близких к 7,0.

Гамма-глобулины устойчивы в течении нескольких часов при 50⁰ С, причем устойчивость их вырастает при добавлении различных веществ, из которых наиболее эффективными оказались сахара (невосстанавливающие), например лактоза и аминокислоты, в частности глицерин (У.70 д).

Гамма-глобулины обладают широким максимумом поглощения в ультрафиолетовых лучах в области около 280 ммк.

Гамма-глобулины содержат небольшое количество связанных углеводов (галактозы и маннозы), что дает основание отнести их к гликопротеидам. В них содержатся около 1,2 % гексозы и 0,5 % гексозамина. Гамма-глобулин содержит также нейраминовую кислоту и фруктозу. Всего углеводов в гамма-глобулине содержется 6,1 % к содержанию белка (Беттигер, 1960).

Аминокислотный состав гамма глобулинов обладает видовой специфичностью и недостаточно изучен. Наиболее детально и различными авторами исследован аминокислотный состав гамма-глобулинов человека, у животных такие сведения получены в отношении крупного рогатого скота и лошадей.