2.5.7. Риваноловый метод получения гамма-глобулина

Риванол впервые был применён для фракционирования сывороточных белков чехословацким исследователем Горжейши (1952 г). Им было установлено, что при добавлении к сыворотке крови водно-риванолового раствора происходит осаждение альбуминов, бета- и альфа-глобулинов. Основная масса гамма-глобулинов остаётся в фильтрате. В дальнейшем Горжейши, совместно с Сметана (1954 г), были разработаны детали фракционирования сыворотки и предложена методика получения гамма-глобулина с помощью риванола.

Выделение гамма-глобулина этим методом проводится следующим образом. К одному объёму сыворотки крови постепенно добавляется три объёма раствора риванола в 0,4 %-ной концентрации, в результате чего в осадок выпадают альбумины и основная масса альфа- и бета-глобулинов. Гамма-глобулин при таких условиях остаётся в растворе.

Кроме гамма-глобулина, в растворе остаётся риванол, который удаляется активированным углём и фильтрацией через бумажные фильтры в воронках. При этом добавляется 10 г угля на 100 мл раствора. Смесь тщательно перемешивается. Полученный прозрачный раствор гамма-глобулина подвергают лиофильному высушиванию.

Технология получения гамма-глобулина риваноловым методом очень проста, занимает мало времени, не требует дорогостоящего оборудования, однако имеет некоторые недостатки:

1. Полученная фракция гамма-глобулина содержит примеси бета- и альфа-глобулинов.

2. Необходимо очищать фильтрат от риванола активированным углём и последующей фильтрацией.

3. Необходимо высушивать большие объёмы раствора гамма-глобулина, т. к. сыворотка, на первом этапе получения гамма-глобулина, разводится раствором риванола в четыре раза.

4. Невозможно получить другие фракции белков сыворотки, т. к. под воздействием риванола выпавшие в осадок белки денатурируют.

Всё вышеизложенное заставило исследователей проводить усовершенствование риванолового метода и предлагать для практики его различные модификации.

Так Шкваржил (1957 г) разработал комбинированный способ получения гамма-глобулина с использованием спиртового и риванолового методов.

В нашей стране модификацию риванолового метода провела Губенко Т. Л. (1960, 1961). Она модифицировала метод, видоизменив его таким образом, в результате чего вместо активированного угля для освобождения сыворотки от риванола бы использован раствор хлористого натрия в 0,85 % концентрации. Гамма-глобулин на последней стадии осаждается 96⁰ С спиртом с таким расчётом, чтобы конечная концентрация его в сыворотке составляла 25 %. Губенко Т. Л. провела исследования по изучению условий, способствующих лучшему фракционированию сыворотки.

Позднее, отечественными учёными были предложены другие варианты получения гамма-глобулина риваноловым методом.

3. Контроль готового препарата гамма-глобулина

Гамма-глобулин контролируется по химическим, бактериологическим, иммунологическим показателям, к которым относятся:

- процентное содержание белка;

- чистота гамма-глобулиновой фракции;

- стерильность;

- безвредность;

- специфичность.

Определение процентного содержания белка. Проводится рефрактометрически, с использованием рефрактометра РДУ (табл 4). Определение ведут при 20⁰ С.

Показатель преломления в растворе белка зависит не только от концентрации белка, но и от наличия в препарате хлористого натрия и остаточного спирта.

Показатель преломления 10 % раствора чистого гамма-глобулина равен 0,01872; показатель преломления остаточного спирта (до 6 %) – 0,003. Общий показатель преломления раствора гамма-глобулина при этом соответствует 1,35675.

Практически нужно доводить растворение гамма-глобулина до показателя преломления – 1,357.

Таблица 4

Пересчет показателей преломления рефрактометра

на показатель преломления и процент белка по Рейссу

№ п/п	Показатель преломле-ния	Сыворотка крови		№ п/п	Показатель преломления	Сыворотка крови
		Отсчет по шкале	Белок в %			Отсчет по шкале	Белок в %
1	1,33705	25	0,63	25	1,34612	49	5,90
2	1,33743	25	0,86	26	1,34650	50	6,12
3	1,33781	27	1,08	27	1,34687	51	6,34
4	1,33820	28	1,30	28	1,34724	52	6,55
5	1,33858	29	1,52	29	1,34761	53	6,77
6	1,33906	30	1,74	30	1,34798	54	6,98
7	1,33934	31	1,96	31	1,34836	55	7,20
8	1,33972	32	2,18	32	1,34873	56	7,42
9	1,34000	33	2,40	33	1,34910	57	7,63
10	1,34,048	34	2,62	34	1,34947	58	7,85
11	1,34086	35	2,84	35	1,34948	59	8,06
12	1,34124	36	3,06	36	1,35021	60	8,28
13	1,34162	37	3,28	37	1,35058	61	8,49
14	1,34199	38	3,50	38	1,35095	62	8,71
15	1,34237	39	3,72	39	1,35132	63	8,92
16	1,34275	40	3,94	40	1,35169	64	9,14
17	1,34313	41	4,16	41	1,35205	65	9,35
18	1,34350	42	4,38	42	1,35242	66	9,57
19	1,34388	43	4,60	43	1,35279	67	9,78
20	1, 34420	44	4,81	44	1,35316	68	9,99
21	1,34463	45	5,03	45	1,35352	69	10,20
22	1,34500	46	5,25	46	1,35388	70	10,41
23	1,34537	47	5,47	47	1,35425	71	10,62
24	1,34575	48	5,68	48	1,35461	72	10,76

Определение чистоты гамма-глобулиновой фракции. Проводят электрофоретически. Для этой цели применяют боратный буфер (на 5 л буфера берут: борной кислоты – 43,414 г; NаОН – 14,0 г; концентрированную НСl –12,7 мл) и краситель, содержащий в 1 л 5 % уксусной кислоты, 2 г хлористого аммония, 10 г каломеля и 1 г бромфенол синего. Смесь оставляют на ночь при помешивании и фильтруют. Режим разгонки - 16-18 часов при силе тока 0,5 ма на 1см ширины бумажной ленты.

Определение стерильности препарата. Проводят путём высевов гамма-глобулина на питательные среды МПБ и МПА. Посевы выдерживают при 37⁰ С в течение 8 суток.

Определение безвредности препарата. Контроль на безвредность проводится с использованием лабораторных животных - морских свинок и белых мышей.

Морским свинкам весом 250-350 г вводят подкожно 3 мл, а белым мышам весом 15-20 г - 0,5 мл гамма-глобулина. За животными наблюдают 5-7 дней. За это время у морских свинок не должно быть воспалительных реакций на месте введения препарата, мыши должны оставаться здоровыми.

Контроль на специфичность. Проводят в случаях получения специфического иммунного гамма-глобулина. Проводится так же, как и контроль соответствующей иммунной сыворотки. Дозы гамма-глобулина берут в 5-10 раз меньше доз исходной сыворотки.

Для определения специфичности гамма-глобулина проводят реакцию агглютинации на стекле, используя в качестве антигена микроорганизм, антитела против которого должны находиться в препарате. При положительной реакции образуются хлопья, следовательно гамма-глобулин обладает специфичностью.

Также вводят белым мышам подкожно 0,01 мл гамма-глобулина и 500 млн микробных клеток возбудителя. Если изменений в общем состоянии животных не наблюдается, препарат является специфичным.

Хранение гамма-глобулина и срок годности.

Гамма-глобулин должен храниться при температуре 4⁰-10⁰ С. Срок годности гамма-глобулина - 1,5-2 года с момента изготовления препарата.