2.5.6. Спиртово-хлороформенный метод получения гамма-глобулина

Сыворотку подкисляют соляной кислотой, разведенной 1:5, при рН 5,1-5,2. (на 1 л сыворотки требуется 15-20 мл разведённой кислоты).

При установлении рН удобно пользоваться индикаторной бумагой, окончательную проверку рН производят потенциометром.

Подкисленная сыворотка прогревается при помешивании на водяной бане (t = 60-70⁰ С). Сыворотку прогревают до температуры 40-42⁰ С и выдерживают при этой температуре 10-15 мин.

Сразу же после прогревания к тёплой сыворотке добавляют химически чистый хлороформ, из расчёта 3 % к объёму (30 мл хлороформа на 1 л сыворотки).

Смесь сыворотки с хлороформом в тёплом виде эмульгируют в специальном эмульгаторе в течении 3-5 мин. Эмульгирование ведут таким образом, чтобы не было сильного пенообразования, которое ведёт к денатурации белка.

Образованная таким образом сыворотка приобретает густую консистенцию и беловатый цвет за счёт выпавших в осадок бета- и альфа- глобулинов. После эмульгирования сыворотка пропускается через сепаратор марки АСГ-3М, выпускаемый Плавским машиностроительным заводом «Смычка» или через высокооборотную центрифугу.

Осадок, полученный в результате сепарирования, представляет собой липопротеиды и является отходом производства.

Центрифугат содержит гамма-глобулин и альбумин и является дальнейшим рабочим раствором, из которого непосредственно осаждают гамма-глобулин. Центрифугат должен быть прозрачным, в противном случае может произойти загрязнение гамма-глобулина белками липоидного характера.

В полученном центрифугате устанавливают рН 7,0-7,2 молярным раствором бикарбоната натрия, для чего требуется 50-60 мл раствора на 1 л фильтрата (одномолярный раствор бикарбоната натрия готовится растворением 84,02 г NaHCO₃ в 1 л дистиллированной воды).

После доведения рН замеряют общий объём фильтрата и раствор охлаждают до 0⁰ С. Затем к жидкости в холодной камере добавляют 50 %-ный этиловый спирт (готовят смешиванием 5 л 96⁰-ного спирта с 4,6 л дистиллированной воды), предварительно охлаждённого до –10⁰ С. Охлаждённый спирт добавляют в количестве, равном объёму надосадочной жидкости, через систему капилляров при непрерывном помешивании сыворотки мешалкой. К концу добавления концентрация спирта в сыворотке достигает 25 %, а температура смеси не должна превышать –5⁰ С. Смесь оставляют при этой температуре на 18-24 часа для формирования осадка гамма-глобулина.

К следующему дню гамма-глобулин в виде белого рыхлого осадка оседает на дно. Надосадочную жидкость декантируют, а осадок, уплотнившийся на холоде, сепарируют сепаратором АСТ-3М или фильтрованием на брюкнеровской воронке под вакуумом через обычный бумажный фильтр.

Отделение осадка гамма-глобулина осуществляется при температуре не выше –5⁰ С.

Фильтрование гамма-глобулина на брюкнеровской воронке под вакуумом является более удобным, чем сепарирование. При фильтрации достигается хорошее уплотнение осадка (с растрескиванием) и удаление из него спирта с воздухом.