2.5.1. Электрофоретическое разделение белков

Метод основан на том, что молекулы белка обладают электрическим зарядом, величина и знак которого определяются аминокислотным составом белка, рН и ионной силой окружающей среды.

Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы передвигаются в растворе противоположному заряженному полюсу. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации.

Широкое распространение, в настоящее время, получил так называемы «зональный электрофорез» - электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением рН.

Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем, обычно бромфениловым синим, амиловым черным и др.

Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, т.к. количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково (по данным С.Е.Северина, 1989г).

2.5.2. Разделение белков методом хроматографии

Современные хроматографические методы позволяют довольно быстро выделять белки их небольшого количества сложной смеси.

По механизмам разделения хроматографию подразделяют:

- адсорбционная (газовая или жидкостная);

- осадочная;

- ионообменная;

- распределительная;

- гельфильтрационная (гель-хроматография);

- биоспецифическая (афинная) хроматография.

По форме проведения хроматографию подразделяют:

- колоночная;

- хроматография на бумаге;

- хроматография в тонком слое.

Для фракционирования белков применяется, главным образом, хроматография на колонках.

Однако из большого числа предложенных методов получения гамма-глобулина производственное значение имеют немногие. К ним относятся: солевой, спиртовый, риваноловый, спиртово-хлороформный методы.

2.5.3. Ультрафильтрационный метод выделения гамма-глобулина

В настоящее время разработан метод выделения гамма-глобулина методом ультрафильтрации. Для этого используют ультрафильтрационные модули на полых волокнах, отличающиеся пределом задержания по молекулярной массе на 5000, 15000, 50000, 100000 дальтон. В соответствии с этим используют модули УФУ-5, УФУ-15, УФУ-100, УФУ-50.

Для задержания гамма-глобулинов лучше использовать установку УФУ-100, обеспечивающую полную задержку гамма-глобулинов в фильтрате, т.к. молекулярная масса гамма-глобулина составляет 160000-900000 дальтон.

Производственные опыты по ультрафильтрации сыворотки дали возможность сконцентрировать её в 3 раза и практически без потерь иммуноглобулиновых компонентов (Школьников Е.Э. и др., 1996).

2.5.4. Метод солевого фракционирования (высаливание)

Метод солевого фракционирования основан на различной способности осаждения различных белков сыворотки крови при разной концентрации соли, постоянных рН и температуре.

Классический метод выделения глобулинов и альбуминов из сыворотки крови основан на ступенчатом добавлении сернокислого аммония в сыворотку. Впервые этот метод был применен в России в 1908 г. Дзержговским и Предтеченским.

При осторожном прибавлении сульфата аммония к сыворотке крови гамма-глобулины осаждаются при концентрации соли 1,34 моль/1 л раствора; бета- и альфа-глобулины, соответственно, при концентрации соли – 1,64 и 2,05 моль/л , а альбумины- при концентрации – 2,67 моль/л .