Синтез пиримидинов de novo. Причины формирования оротацидурии. Пути лечебного воздействия при оротацидурии.
Оротацидурия. Причины: (1) нед. ферментов образования и декарбоксилирования оротидин-5’-Ф (не обр. УМФ) → накапл. оротовая к-та. Пиримидиновый голод, гибель в первые годы жизни. Лечение: вв. УМФ. (2) гипераммониемия. Наруш. любого, кроме первого, ферм. синтеза мочевины. Карбамоилфосфат из мтх → в ц/пл → изб. на синтез пиримидинов. (3) лечение аллопуринолом. Ингиб. декарбоксилазу оротидинмонофосфата (6) → накапл. оротат.
Биосинтез дезоксирибонуклеотидов. Акт. только на стадиях подготовки к синт. DNA. Осущ. мультиферм. комплекс – РибоНуклеотидРедуктаза (РибоНуклеозидДифосфатРедуктазный комплекс). Субстр. – дифосфаты.
ADP (РибоНуклеозидДифосфатРедуктаза; тиоредоксин-(SH)2→тиоредоксин<SS+H2O) → dADP (киназа; ATP→ADP) → dATP
GDP → dGDP → dGTP; CDP → dCDP → dCTP. Обратно - NAD-dep. (тиоредоксин восст.)
Для dTTP:
Действие противоопухолевых преп. в синт. пиримидинов: метотрексат (аналог фолата, ингиб. дигидрофолатредуктазу), 5-F-урацил (синт. F-dUMP, ингиб. тимидилат синтазу), 5-F-UMP → 5-F-UTP (встр. в RNA, кот. утрач. норм. ф-ии).
Строение и физико-химические свойства днк.
DNA – полинклтд. Перв. стр-ра – цепь мононклтд, соед. фосфодиэфирной св.
Втор. – двуцепочечная стр-ра. Направление антипараллельное. Удерж. с пом. водор. св. А=Т, Г≡Ц. Также удерж гидрофобн. св. (стекинг-вз/д). B-DNA 1 виток=10 пар нклтд, d2нм, l=1,5-1,7 нм. A-DNA виток шире, короче (11 пар), хар-на для репликации. Z-DNA 9 пар. Стадия интерфазы.
2sDNA кольц. – прокариотич., 1sDNA кольц. – у бактериофага.
Трет. стр-ра – DNP. Стр-ра нуклеосом, d=11 нм. Нуклеосома сод. ок. 200 пар нклтд, имеет кор (сердцевину). Белки (гистоны, (+)-зар.), фосфатн. гр. → удерж. 8 мол. гистонов составляют кор, вокруг которого – 1,75 витка DNA. Линкерная DNA – ок. 50 пар нклтд, присутств. гистон Н1. Вокруг кора – 146 пар нклтд + 50 пар линкерной DNA.
Четв. стр-ра. Цепочка укорач., утолщ., d=130 нм. Формирование петель, удерживаемых негистоновыми белками (хромомеры). Обр. хромонема → хромосома (d=1400 нм).
мтхDNA – циклич. стр-ра, 16569 пар нклтд, кодир. 13 б. (б. дых. цепи), кодир. tRNA (22 гена).
20% хроматина – негистон. б. Все нигстон. б. имеют четкие сайты связ. с DNA (цинковые пальцы). Н/г б.: 1) цинковые пальцы (5 сайтов св.), 2) HMG-белки (оч. высок. скорость движ. при ЭФ), 3) б., в сост. кот. есть втор. надстр-ра (спираль-поворот-спираль).
Физ-хим св-ва: М 3*10^9 Да. Показатель плотности: метод ультрацентриф. (ЦФ зонально-скоростное, CsCl), =1,69-1,73. Есл денатурир., то плотность выше.
Денатурация DNA – разруш. неков. водор. св. Факторы: тем-ра, рН, мочевина в опр. концентр.
Плавление DNA: 50-60˚ денат. нет, при ↑тем-ры проявл. гиперхромный эфф., далее – эфф. кооперативности. Тплав = тем-ра, при кот. 50% DNA денатур. (у чел-ка – 81,5˚, у E. coli – 90,5˚). Тплав зависит от кол-ва пар G≡C. Отжиг – медленн. охл. с возм. формирования обратно 2sDNA.
Методы исследования структуры днк. Гибридизация, секвенирование, пцр.
Рестриктазы – бакт. эндонуклеазы, разрез. мол. DNA . 3 типа: 1) без обр. компл. фрагм., 2) с обр. липких концов, 3) несимметр. (не палиндромы). Сейчас исп. 600+ разл. рестр., чаще – класс 2.
(1) (а) Метод гибридизации. 1969. Плавление 2 разн. фрагм. DNA, обр. денатурир. спирали, от кажд. забир. по 1s → отжиг. Чем больше компл. уч-ков, тем быстрее. Примен. гибр.: док-во родства, картирование генов у прокариот, опр. перв. стр-ры. (б) Метод блот-гибридизации (Саузерн-блоттинг). Бл. – перенос фрагм., разд. методом гелевого ЭФ, на тверд. носит. (нейлон, нитроцеллюлоза) под действ. капиллярных сил. Саузерн: исп. радиоакт. зондов. Внос. доп. краситель, далее – присоед. овидин. Внос. щелоч. фосфатаза и ее S (изм. ск. абс.). Либо: флуоресц. метки (не нужно прокраш.) = FISH. Исп. зондов при диагн. генетич. заб. (in situ: можно опр. один ген).
(2) Секвенирование. Опр. перв. стр-ру. (а) Сенджер. 800-1000 нклтд. ДиДезоксиСекв. Синт. изучаемой DNA in vitro с остановкой синт. путем присоед. dd-нклтд, у кот. отсутств. 3’-OH → «метод обрыва цепи». dd-нклтд = терминаторы. Матрица – 1sDNA, к кот. присоед. радиоакт. меченый праймер. 4 пробирки (матрица DNA, праймер, DNA-pol., 4 dNTP, буфер с Mg2+) → в каждую пробирку – по одному dd-нклтд → гель, 4 лунки, эл. ток → разделение с разрешением в 1 нклтд → опр. посл-ти. Усовершенствование метода: замена радиоакт. метки на флуоресц. 2001 – расшифр. геном чел-ка с пом. секв. (б) Пиросеквенирование. 1996. Синт. DNA DNA-pol., сопр. с работой ферм. люциферазы (хемилюминесц. метод). Рег. присоед. кажд. нклтд., высвоб. пирофосфат PPi. Ферм. сульфурилаза → встр. а ATP, ферм. люцифераза превр. люциферин в оксилюцеферин → свет. Метод компьютеризирован. Нклтд вводятся кадж. отдельно, присоед. через пористый планшет. Сейчас – ок. 1000 нклтд.
(3) ПЦР. Компоненты: DNA-матрица, сод. тот уч-ок, кот. треб. амплифиц.; 2 праймера; Термостаб. DNA-pol. (Taq-пол., Pfu-пол., Pwo-пол.), dNTP, Mg2+, буфер. +Масло, чтобы смесь не испарялась. Ход: обычно 25-30 циклов. 1) денатурация, 2) отжиг, 3) элонгация.
(4) Клонирование. Вв. вектор в бактерию/бактериофага.