Прямой конкурентный формат ифа использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела, а меченый ферментом и немеченый антиген конкурируют за связь с иммобилизованным антителом.
К иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена.
Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.
В непрямом конкурентном формате ифа используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель.
Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА. На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов, причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена.
Применение универсального реагента — меченых антивидовых антител — даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.
В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяют на:
Лизатные — в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);
Рекомбинантные — в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;
Пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков.
ОБМЕН И ФУНКЦИИ НУКЛЕОТИДОВ
Биосинтез и катаболизм пуриновых нуклеотидов. Регуляция биосинтеза.
De novo (90%)/из готовых пуриновых осн.
Источники атомов пуринового кольца (ТГФК – ТетраГидроФолат, он же Н4-фолат):
Фолиевая (птероилглутаминовая) к-та. Производные Н4-фолата – доноры одноуглеродных фрагментов.
I. De novo:
1) Рибозо-5-фосфат (ФРПФ-синтетаза, ATP→AMP)→ 5-ФосфоРибозил-1-ПироФосфат (ФРПФ, он же ФРДФ)
2) ФРПФ (ФРПФ амидотрансфераза, Gln→Glu) → 5-ФР-1-амин
3) 5-ФР-1-амин → 7 р-ий, 5 АТР → ИМФ (инозин-5’-монофосфат)
Подробнее: ФР-амин NH2-Rib(P) (+Gly; ATP→ADP+Pi) → ГлицинАмид-РибоНклтд NH2-CH2-C(O)-NH-Rib(P) (метенил-Н4-фолат → Н4-фолат) → ФормилГлицинАмид-РибоНклтд CHO-NH-CH2-C(O)-NH-Rib(P) (Gln→Glu; 2ATP→2(ADP+Pi)) → АминоИмадазол-РибоНклтд, цикл замкнулся (+Asp; +CO2; 2ATP→2(ADP+Pi)) → АминоИмидазол-N-Сукцино-КарбоксАмид-РибоНклтд, к углероду через –С(О)- навесился Asp COOH-CH2-CH(COOH)-NH-C(O)-АминоИмидазол-РибоНклтд (–фумарат) → АминоИмидазол-КарбоксАмид-РибоНклтд (формил-Н4-фолат → Н4-фолат) → ФормАминоИмидазол-КарбоксАмид-РибоНклтд (–Н2О) → Инозин-5’-моноФосфат-РибоНклтд
4) ИМФ → АМФ и ГМФ
Подробнее:
1. IMP (ИМФ-дегидрогеназа; +H2O; NAD+→NADH+H+) → КсантозинМоноФосфат (ГМФ-синтетаза; Gln→Glu; ATP→ADP+Pi) → GMP: для синт. GMP требуется 7 ATP
2. IMP (аденилосукцинат синтетаза; Asp→H2O; GTP→GDP+Pi) → АденилоЯнтарная к-та (аденилосукцинат лиаза; –фумарат) → AMP: для синт. AMP требуется 6 ATP и 1 GTP
5) Образование НуклеозидТриФосфатов из НМФ:
GMP (нуклеозидмонофосфат киназа; ATP→ADP) → GDP (нуклеозиддифосфат киназа; ATP→ADP) → GTP
AMP (нуклеозидмонофосфат киназа; ATP→ADP, ADP – в след. р-ию) → ADP (АТР-синтаза; +ADP) → ATP
II. Путь спасения (синтез из аденина и гуанина)
Аденин + ФРПФ (Аденин-ФосфоРибозил трансфераза) → АМФ
Гуанин/Гипоксантин + ФРПФ (ГГФРТ, Гипоксантин-Гуанин-ФосфоРибозил трансфераза) → ГМФ/ИМФ
Регул. синтеза пуриновых нклтд: 3 осн. пути регуляции. (1) ГТФ требуется в синт. АМФ, АТФ – в синт. ГМФ, след. поддерживается баланс А и Г нклтд. (2) ФРПФ-амидотрансфераза – Ключ. ферм., имеет 2 центра аллостер. регул. (для АМФ; для ГМФ и ИМФ). (3) АМФ и ГМФ регул. ФРПФ-синтетазу.
Аналоги пуриновых осн. как ингибиторы синт. пуриновых нклтд (противоопухолевые препараты): 6-меркаптопурин и тиогуанин.
