1.Простые(протеины)-Ак. Нет небелковых добавок

2.Сложные(+небелковые компоненты)

Простые:

По растворимости

Альбумины (растворенные в воде, частично осаждающиеся при 65% насыщ.сульфатом аммония, полное понижение при 100) Глобулины (раствроимы в слаб.растворах нейтр.молей, при 50% насыщении-высаливаются, в чистой воде-не очень хорошо). Проламины (много ак пролин,растворяется хорошо в спирте,харкатерны для семян злаков.) Глютелины( простые белки,много диаминомонокарбоновых кислот,в составе клековины злаков,очень мощные аллергены) Гистоны(Щел.белки,до 30% аргенина и везина,форм.хроматин в ядрах). Протмаины (оч мал.(12.000),много в сперматоз.борятся с передозировкой гипарина,80%аргинина и лизина,pJ=12.)

Сложные белки (обязат.имеют небелковые компоненты, он и дает название, раньше протеид,теперь пишем добавку хрома….ин). Хромопротеиды (имеют хроматофорн. группу(2%), может поглащать свет,окрашивается,гемоглобин. Флавинадениннуклеотид-желтый. Нуклеопротеины(небелковая добавка Днк или Рнк,белка меньше чем небелковой массы).

Фосфопротеины(молоко,яйца,в икре рыб-ихтуллин,фосфатн.гр.от 2-3 до 10%).

Линопротенины(добавка:холестерин,его эфиры,полярные липиды,много в мембранах,русле крови). Протеолипиды(много белка с липидами,но липидн. компонент преобладает в миелиновых оболочках.) Ликопротеины(белки,в составе кот. углев.( Добавки до 15-20 моносахаридов), много из белков плазмы крови, антитела, вкомпонентах слизи). Гемааглютинины- взаимод. с гр. специф. в-в. И склеивают друг с другом гликопротеины.

Фитогемаглютинины-вырабатывается из природных ве-в. Лектины-специфически связывают полтисахариды и углеводосодерж.биополимеры. Конканавалин-лектин, растительный,легко связывающий их особо специфич гликопротеины,ис. В хроматографии. Протеогликаны-преобладают белки.

9. Методы выделения и очистки белков.

Выделение.

1ый этап-разрушение кл. (Дробление биологич. материала) Методы гомогенизации: ножевой (похож на блендер, разрезает все субклеточные структуры организма), ультразвуковые диспенсеры, стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком (для нежных тк. – со стеклянным пестиком), вбрация, выс. давление, осмотич.шок., замораживание/оттаивание.

- Хелатирующий компонент ЭДТА(буфер,кот наливаем) = Этилендиаминтетраацетат. (COC-H2C)2- N-CH2-CH2-N-( CH2-COO)2 Работать в холодной комнате(+2;+4) (отведение тепла от денатурации).

- SDS (додецил сульфат). [CH3-(CH2)10-CH2-OSO3](–) Na(+)

- β-меркаптоэтанол (защита SH-гр. от окисления)

- ингибиторы протеиназ

2Й эт. Дифференциальное центрифугирование (субфракционирование)

сначала осажд. неразруш. фракции (обычно – 300 g), затем – нач. центрифугир.

600 g – выпадает фракция кл. ядер. 15000 g – мтх фракц. 105000 g – микросомальная фр. Остается надосадочная жикость – супернатант – с растворенными белками цитозоля.

Метод экстрагирования – перевод б., связ. прочно с к.-л. стр-рами кл. в р-р. Исп. солевые, водно-спиртовые р-ры, буф. р-ры со слаб. к-тами и щелочами, детергенты. Детергенты: ионные/неионные.

Методы разделения. Дифференциальное центрифугирование исп. градиент плотности, экстракция, высаливание, хроматография, ЭФ.

ЭФ – движение зар. частиц в р-ре или поддерживающ. среде под действ. эл. поля. Тизелиус – НП 1948. Ск. движ. зар. част. = [см/с]. Ск. при напр-ти 1 В/см – электрофоретическая подвижность, зав. от св-в самой частицы (масса, форма, сумм. заряд, растворимость), св-в окр. среды (сила прилож. напряжения, рН, тип носителя и др.). Виды ЭФ: (1) по наличию носителя: фронтальный (свободный; без носителя) / зональный (с носителем). Фронтальный – все чат. движ. компактно, в одной полосе, границы линий движ. – линии фронта, исп. слабые токи, больш. длит. Разд. на 5 осн. зон (белки крови). Выявл. зон при зональном ЭФ: исп. спец. красители, радиоизотопн. метки, флуоресц. метки, исп. разл. субстраты, исп. этидиумбромид. Далее – исп. денситометры. (2) по цели использования: аналитический (пров. анализ), препаративный (получение б. препарата). (3) по технике исп.: гориз./вертик., одномерн./двумерн.(получ. фингерпринта). (4) по интенсивности приложенного напряж.: низко- (до 500В)/высоковольтные (до 10 тыс. В).

ЭФ подвижность зав. от: величина заряда → скорость движ., знак заряда → направл. движ.; pH<pI → б. приобр. (+), pH>pI → аминогр. не диссоц., (-). Для больш-ва б. pI – в слабокислой среде. Также подвижность определяют: Размер, форма, масса мол. Режим ЭФ (условия опыта). Ионная сила р-ра. Поддерживающие среды: хроматографическая бумага (плохо, долго, зоны размытые), тонкие слои (окиси Al, Si; гидрофильные соед. разгоняются плохо), агар-агар (30 мин, 8 фракций), ПААГ (полиакриламид, м.б. исп. вертик. подложки, до 20-32 фракций).

Разновидности ЭФ: непрерывный, изоэлектрическое фокусирование, изотахофорез, клинический (капиллярный).

ХГ – сорбц. динамич. метод для раздел. в-ва. Основа: разл. в ск. движ. комп. смеси подв. фазы под влиянием неподв. фазы. Классиф.: (1) по сост. фазы: 1. жидкостная (жидк.-жидк., жидк.-тв.), 2. газовая (газо-жидк., газо-тв.). (2) по принципу разделения: 1. адсорбционная (физич. сорбция в-в за счет сил св., носитель – уголь, силикагель; жидкость – элюент (подв. фаза), в-ва промыв. элюирующим буфером, если в-во не связ. с буфером, то оно выходит из колонки – элюат, сорбированные в-ва затем сниж. последовательно); 2. распределительная (распределение в-в между двумя жидкими неперемешив. фазами, неподв. фаза = жидк. в порах носителя, подв. фаза = орг. гидрофобн. в-во). По относительной полярности раств.: нормально-фазовая (неподв. фаза более полярна, напр., хлороформ:метанол), обращенно-фазовая (неподв. ф. менее полярна, напр., метанол:вода). 3. гель-проникающая (молекулярно-ситовая). Мол. разд. за счет разл. спос. проникать в поры сорбента. Носитель пористый. Неподв – внутри гранул (подв. и неподв. – одна и та же жидк.). Оч. крупное в-во не заходит в поры, и оно выходит из колонки в первую очередь, в-во малого размера застревает в каждой грануле. 4. ионно-обменная. Разд. за счет заряда б. Носитель – смолы, у/в. 5. аффинная ХГ. Биоспецифичная. 6. ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная ХГ). Под давлением в 400 бар. Выд. пикомольные концентр. Совм. с распределительной и адсорбционной, колонки исключительно металлические. (3) по форме проведения процесса: колоночная, плоскостная, капиллярная. (4) по направлению движения: восход., нисход., радиальная. (5) одно-/двумерная. (6) по цели: аналитическая, препаративная.

Центрифугирование. Основ. на разном поведении в-в в центрифуг. поле (зав. от плотности, формы, разм.). До 700 000 g. Классиф.: (1) по цели: аналитич./препаративн. (2) виды: 1. дифференциальное (мн. этапов, на каждом – одна фракция по коэфф. седиментации, исп. разл. ск. и время вращ.). 2. зональное проводится в р-ре с градиентом плотности, исп. в осн. в аналитич. Исп. бакет-роторы (пробирка встает горизонтально, зоны разделяются четко).

Очистка белков. -сначала разделение (для этого нужно опираться на разницу в размере, заряде, Mr, способности связываться, растворимости).

1ый подход к очистке. (Базируется на растворимости, высаливание, солевое растворение, широко используют).

2ой подход. (на основе размера, формы и Mr молекулы)

(Диализ,гель-фильтрация,ультрацентрифугируется,SDS-ПААг ЭФ). Диализ (целофановый пакет или воронка). Гель-фильтрация (большие мол. выходят первыми)

3ий подход. (разделение на основе заряда белка).

1) ион-обменная ХГ(хроматография).1ым буфером вымываем раствор,расшатываем 1 связь.уходит №1.Берем более сильный и уходит №2.Еще сильнее и №3.

2) высокоэффективная жидкостная ХГ

3) ЭФ(гель-ЭФ,изоэлектрич.(ЭФ) фокусирование,капиллярный ЭФ)

4ый подход.(разделение с помощью специф.связывания.)

1) афинная ХГ-по сродствку.

2) осождение антителами.антигены реагир.и уходят в осадок

Очистка от низкомолекул.примесей (гель фильтрация,ультрацентрифугиров;

4 подхода: диализ-крестализация-обессаливание-ультрафильтрация

10. Электрофорез как метод разделения белков. Клиническое значение протеинограмм.

Белки, как и а/к, амфотерны благодаря наличию своб. NH₂- и СООН-групп, им хар. все св-ва к-т и осн. В зав. от р-ии среды и соотн. кислых и осн. а/к б. в р-ре несут (+)/(–) заряд → к аноду или катоду → исп. при очистке методом электрофореза. ЭФ – см.№ 9.

11. Хроматографические методы разделения белков. Смотри №9

12. Оценка степени очистки. Способы определения молекулярной массы белков.

Очистка белков.

-сначала разделение,для этого нужно опираться на разницу в рвзмере,заряде,Mr,способности связываеться,растворимости.

1ый подход к очистке.(Базируется на растворимости,высаливание,солевое растворение,широко используют)

2ой подход.(на основе размера,формы и Mr мол.)(Диализ, гель-фильтрация, ультрацентрифугируется, SDS-ПААГ ЭФ)

Диализ (как целлофановый пакет или воронка).Гель-фильтрация(большие мол. Выходят первыми).

3ий подход.(разделение на основе заряда белка)

1) ион-обменная ХГ(хроматография).1ым буфером вымываем раствор,расшатываем 1 связь.уходит №1.Берем более сильный и уходит №2.Еще сильнее и №3.

2) высокоэффективная жидкостная ХГ

3) ЭФ(гель-ЭФ,изоэлектрич.(ЭФ) фокусирование,капиллярный ЭФ)

4ый подход.(разделение с помощью специф.связывания.) 1.афинная ХГ-по сродствку.2.осождение с пом. АТ)

Очистка от низкомолекул.примесей (диализ, кристаллизация, обессоливание, ультрацентрифугирование).

Оценка степ. очистки (проверка на гомогенность). Обяз. исп. неск. методов. Проверяют на гомогенность. Чтобы на хроматографии была одна полоса, на электрофорезе тоже. Проверять как мин. на 2ух препаратах,лучше на 3-4-подходами. 1.Метод седиментационного анализа (осаждение; сущ. спец табл.: скор. ротора, ск. движения; определяют очень точно.) 2.Электрофорез в ПААГ с SDS .3.Гель-фильтрация. Берем серию колеблющих белков, пропустим через сифодекс белок. K=Ve-Vo\Vs. Ve-объем элюирования, чтобы вымыть белок из колонки.Vo-очень мало V.Vs-V внутр. растворитель внутри гранулы.K-константа.

Опред Mr

-Ультрацентрифугирование.Svedberg.S=v\w² × r.(S-константа седементации(осождение) v –ск.перемещ.границы между растворителем и белком w-углова скорость ротора(рад\с) r-радиус ротора(см).)S-единица измерения(Сведберг). Характеристика эукаротических рибосом 80 S и прокариотич 70S Дедоцил превращает белок в палочку и переориентирует его и создает – заряд. Когда помещаем разн.белки и ток, то все движутся к аноду. Мелкие движутся быстро, большие медленно. Деление главным образом по Mr, размеру и форме.

13. Стратегия изучения структуры белковой молекулы.

1. Анализ первичной структуры

   1. Определение АК состава белка

      1. Горячий кислотный гидролиз: 6М HCl температура 110, 24 часа в стеклянной ампуле –> аминокислотный гидролизат. Разруш АК пропорц времени.

      2. АК-ный анализатор. Хроматографическая колонка разделяет кислые и основные АК вымыванием. Количество АК учитывается с помощью нингидриновой реакции или с помощью флюорескатина.

   2. Определение АК-ной последовательности.

      1. Определение числа протомеров в молекуле белка. Заключение о числе протомеров делают, подсчитывая число NH2-концевых остатков, приходящихся на одну молекулу белка.

      2. Разрушение S-S связей и проведение селективного гидролиза, позволяющее получить фрагменты полипептидной цепи:

- S-S разрушение с помощью муравьиной кислоты

- Селективный гидролиз – гидролитическое расщепление полипептидных связей по определенным положениям последов-ти АК в протомере

Селективные протомеры

1. Хемотрипсин - разрушает связи, образованные фенильными АК (ароматическими)

2. Трипсин - режет по аргинину

3. Бромициан - по карбонильной группе в метианине.

4. Бромсукцининимид – по карбонильной группе триптофана

5. Гидроксиламин – разр.связь между аспарагином и глицином

Для селективного гидролиза исп. не менее двух агентов

Установление порядка чередования

С N- конца: Реакция Сенджера с фтординитробензилом.

Реакция с Дансилхлоридом.

Реакция Эдмана с фенилизотиоцианатом (для короткого полипептида).

Метод Акабори (расщепление связей с помощью гидразина при 100 ͦ в безводной среде)

Аминопептидазы отщепляют крайнюю концевую АК с N-конца

Карбоксипептидаза - идентификация с С-конца

Цветные реакции на АК

1. Ксантопротеиновая реакция - выполняется на циклические АК в резкокислой среде. Если продукт желтого цвета – есть цикл. АК

2. Реакция Фолля – серосодержащие АК (красный продукт+)

3. Реакция Милона на тирозин в HNO3 (пурпурный цвет+)

4. Реакция Паули на ароматические АК и гистидин

5. Реакция Сакагучи на аргинин (оранжево-красный+)

Определение проядка следования фрагментов в ПП цепи

1. Логический вывод по результатам не менее 2 исследований

2. Спектрометры

3. По последовательности нуклеотидов, кодирующих этот белок (учитывать интронные вставки!)

Анализ конформации белков

1. Рентгеноструктурный анализ – из белковой структуры изготавливают кристаллич. структуру, выращенную искусственно

2. УФ –спектроскопия (соотношение показаний спектра)

3. Флюоресцентная спектроскопия (тирозин, триптофан, фенилаланин дают флюоресц. явления)

4. ЯМР – спекроскопия – ввод радиоизотопов, кот. могут иметь магнитные ядра, поглощ. в однородном магнитном поле энергию строго определенной резонансной частоты

5. Расчетные методы (молекулярная динамика и механика) – рассчитывают энергию каждого атома белк. молекулы и затем располагают их в пространстве.

6. Дисперсия оптического вращения. Для общего описания β-складачатых структур и α-конформационных спиралей. По-разному вращается плоскополяризованный свет; по-разному поглощается циркулярнополяризованный свет. Вектор направления электрич. поля для всех фотонов светового пучка лежит в одной плоскости – плоскополяризованный свет. Циркулярнополяриз. свет – вектор напряженности описывает спираль.

7. Инфракрасная спектроскопия (Для общего описания β-складачатых структур и α-конформационных спиралей) – белок растягивают на пленках, свет падает вдоль и поперек этой плёнки -> характеристика растянутой молекулы – архитектоника водородных связей.

14. Использование фотометрического анализа в биохимии. Виды абсорбционной и эмиссионной фотометрии.

Фотометрич. анализ относится к спектрометрич. методам иссл. (1) абсорбциометрия (абсорбционная спектроскопия): длина волны и степень зависит как от мол., так и от ее окр.;

(2) эмиссионная спектроскопия: переводят мол. в окрашенную или спос. поглощать свет форму. Ортотолуолидиновый, нитробензольный, паранитрофенольный методы (в основе назв. – соед., переводящее данное соед. в окр. форму).

Теория поглощения света. Свет имеет эл/магн природу и возн. при вз/д эл. и магн. поля. Кванты (фотоны). λ – длина волны. E=hν=hc/λ. Области Max поглощения лучей раствором: 450-480 нм – желтый, 490-510 нм – красный, 575-590 нм – синий. Если в смеси в-в одно поглощает, а остальные – отражают, то это является возм. определить это в-во в смеси. Поглощать в-во будет, только если оно имеет хромофорные группировки. Хромофор – мол. (часть), кот. м.б. возбуждена при поглощении света. Хромоф. гр.: -C=O, -N≡N, -N=O, -N-S, -C(O)NH-, -Arom-, -C=C-.

Погл. только тот свет, кот. соотв. разности возбужденного и исходного состояния. M –(+λν)→M*, М была Е, у М* - Е*. λ=hc/(E*-E).

Типы вз/д энергии с в-вом: (1) погл. эн. может переходить в тепловую, кот. рассеивается в окр. среду, но т.к. кол-во возб. мол. оч. мало, то и кол-во выд. эн. мало, и это не приводит к разруш. в-ва. (2) погл. эн. может приводить к разруш. в-ва, если эн. фотонов оказалась слишком велика (напр., NaNO3 необх. готовить непосредственно перед анализом). (3) релаксация мол. сопровождается флуоресценцией (эмиссивный процесс). (4) в-во может получать доп. эн. при нагревании в пламени, в-во сгорает, а атомы возбуждаются. Итог: -абсорбция, -эмиссия. (Фотометрия пламени).

Фотометрические приборы. Абсорбционная. (1) растворов – ФЭК, СФ. (2) взвесей: а. нефелометрия – нефелометр; б. турбидиметрия – ФЭК, СФ. (3) атомно-абсорбционная спектроскопия – атомный абсорбциометр. Эмисиионная. (1) атомно-эмиссионная спектроскопия (фотометрия пламени) – пламенный фотометр. (2) флуориметрия – флуориметр.

Нефелометр изм. интенс. рассеянного излуч., изм. отклоненный поток. Турбидиметрия основ. на изм. ослабленного потока света. Неф. и турб. – в цитометрах (рег. фракции в плазме крови). Атомный абсорбциометр и плазменный фотометр – в клинике для опр. катионов.

Общ. принцип строения аппаратуры для фотометрии: Источник изл. (лампа, пламя) → монохроматор (призма, дифр. решетка) → исследуемые р-ры → детектор (ФЭ, термопара) → указатель (стрелочный МПУ).

Монохроматор осущ. сужение свет. потока, который напр. на кювету (лучше всего – с диапазонов в одну волну). Кварцевые призмы выщепл. одну длину волны, они исп. в научн.-иссл. апп. ФЭК – диапазон 40-50-60 нм. Дифр. реш. – 3 нм. Иссл. р-р помещ. в кювету (наливная или проточная). Термопара – для длинной дл. волны.

Фотометры: одноканальные (один монохроматор, напр. через одну кювету); многоканальные (8 многохроматоров, кажд. через свою лупу).

Абсорбция (А) (экстинкция, density). A=lg(I0/IT), I0 – падающий свет, IT – поглощенный. При высоких концентр. в-ва зависимость А от [c] отклоняется от линейной. Измер. произв. только в области линейности (опр. экспериментально).

Желательно исп. Max дл. волны, кот. поглощает данное в-во. Необх. выбрать опр. светофильтр.

Биуретовый метод. В обл. Max λ не получится иссл., т.к. маленькая разница. Основан на обр. биуретового комплекса (фиолетовый) пептидных связей белков с Cu(II). Биуретовый реактив: KOH, CuSO4 и цитрат Na.

Этапы подбора оптим. усл. для фотометрии: (1) Выбор длины волны (по пропусканию света данным св/фильтром). (2) Выбор длины рабочего слоя кюветы. (3) Выб. р-ра сравнения (дистилл. вода при неокрашенный р-ах или контрольный р-р в остальных случаях). (4) Выб. временных параметров фотометрии (на основе плато окраски). (5) Построение калибровочного графика А(с).

15. Способы количественного определения белка. Методы определения общего белка сыворотки крови и мочи.

1.Азтометрический метод – определение белкового азота: выжигание органического соединения, а затем расчет остаточного азота. Метод относительно точный.

2.Гравиметрический – работа с осадками

2.1. Центрифугирование (многократное)

2.2. Отмывание (многократное)

3.Рефрактометр – определение уровня белка по показателю преломления (если сыворотка относительно здорового человека; гемолизированная сыворотка = разрушенные эритроциты, хилёзная сыворотка = избыток жиров, эктеричная св-ка = гепатиты – не подходят!)

4.Метод определения по плотности (удельному весу)

5.Спектрофотометрический метод не подходит из-за избытка примесей в исслед. образце

6.Колориметрический метод – качественное определение, основанное на способности белков к образованию цветных комплексов.

7.Турбидиметрический метод – измерение помутнения после осаждения трихлоруксусной кислотой (денатурация+осаждение). Не очень точный. Использ. для количеств. определения белка в моче.

8.Методы, основанные на специфичности сорбции некоторых красителей на поверхности белковой молекулы.

9.Поляриметрический (сухая химия «на полосках»)

II. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ ФЕРМЕНТОВ

16. Общие и специфические свойства ферментов как катализаторов. Виды специфичности ферментов.

Свойства: спецефичность, каталитическая эффективность (кол-во молекул субстрата, превращенных 1 м. фермента за 1 секунду- цикл оборота фермента или молярная активность), лабильность (сп-ть к небольш измен конформации активного центра, засчет разрыва слабых связей), регуляция («метаболические пути», ключевые и регуляторные ферменты).

Индивид особенности активного центра фермента обуславливают специфичность действия фермента на субстрат. В активном центре выделяют центр связывания и центр хим превращения субстрата. Виды спецф-сти:

1. Субстратная спецефичность- способность фермента взаим только с 1 или группой субстратов. Бывает абсолютная (аргиназа, уреаза, работают только с 1 субстратаом), групповая (работают с группой структ похожих субстратов: панкреатическая липаза гидролизует все ТАГ до МАГ; протеолитич ферменты- больш-во белков) и стереоспецефичность (работают с определенной изоформой: D-глю, L-АК, α-гликозидные связи углеводов).

2. Специфичность пути превращений- часть функциональных групп активного центра ф имеет строение и реакционную способность, что обеспечивается хим превращение субстрата в новые вещ-ва. Каждый Ф катализирует не любое из всех возможных хим превращений субстрата, а какое-либо одно.(напр гистидаза и гистидиндекарбоксилаза имеют одинаковую субстратную специфичность,но катализируют разные превращения гистидина).

17. Строение ферментов. Активный и аллостерический центры.

Структура Ферментов: Mr=от15000-до нескл мил.

Ферменты, являясь белками, повторяют все особенности структуры и состава белков (состоят из аминокислот, имеют 4 уровня структурной организации), физико-химические свойства белков. Ферменты, как и все функциональные белки, могут быть простыми и сложными. Простые ферменты представлены только белковой частью (состоят из аминокислот) — пепсин, трипсин, фосфатазы. Сложные ферменты представлены: 1 .Белковой частью (состоит из аминокислот) — апофермент; 2.Небелковой частью. Небелковая часть может быть представлена: • ионами металлов (К, Na, Ca, Mg, Mn); • коферментами — низкомолекулярные органические вещества. Для многих ферментов его апофермент вместе с небелковой частью образуют каталитически активную молекулу, которая называется холоферментом.

В пространственной структуре фермента можно выделить отдельные участки, которые выполняют те или иные функции (активный центр, контактный участок, каталитический участок, аллостерический центр).

Активный центр — это участок в молекуле фермента, где происходит связывание и превращение субстрата. Активный центр обычно располагается в гидрофобном углублении (недоступном для молекул воды), изолируя субстрат от воды. В образовании активного центра, участвуют боковые группы АК (12-20 АК), причём эти АК могут находиться на разных участках полипептидной цепи, но при формировании пространственной конфигурации фермента они укладываются т.о., что располагаются в области активного центра. В образовании активного центра принимают участие следующие группы боковых цепей АК:

– NH2 (арг, лиз);

– СООН (асп, глу);

– SH (цис);

– ОН (сер, тре);

– имидазольное кольцо (гис);

– гуанидиновая группа (арг);

– фенольное кольцо (тир).

Остальные АК поддерживают пространственную конфигурацию активного центра фермента и обеспечивают его реакционную способность.

Контактный (субстрат-связывающий ) участок — это место в активном центре фермента, где происходит связывание субстрата с его активным центром. Контактный участок обеспечивает специфическое сродство субстрата к ферменту.

Каталитический участок — место, где проходит сама каталитическая реакция.

Аллостерический центр — участок в молекуле фермента, пространственно удаленный от активного центра. К аллостерическому центру могут присоединяться различные вещества, которые отличаются по структуре от молекул субстрата. Эти вещества называются аллостерические эффекторы. Они могут влиять на конформацию активного центра фермента, изменяя её, т.е. могут или повышать скорость реакции, или тормозить её.

18. Небелковая часть холофермента. Коферменты нуклеотидного типа, строение, участие в катализе.

Холофермент состоит из белковой части (апофермент) и небелковой (кофермент). Кофермент-это органические вещ-ва не АК природы, участвующие в катализе в составе ферментов. К коФ-ам нуклеотидного типа строения относятся:

1. Никотинамидные коФ : НАД и НАДФ,НАД+2Н-НАДН+Н. Входят в состав ряда дегидрогеназ — катализаторов ключевых окислительно-восстановительных реакций энергетического и пластического обмена. Молекула НАД представляет собой динуклеотид, построенный из аденинрибонуклеотида и никотинамидрибонуклеотида (последний отвечает за проявление каталитической активности НАД), связанных фосфоангидридным мостиком, а НАДФ имеет третий остаток фосфорной кислоты в положении 2' рибозы аденилового нуклеотида. Способность НАД и НАДФ переносить электроны и протоны от окисляемого субстрата к другому акцептору обеспечивает выполнение этими К. важной биологической функции в процессе клеточного дыхания. В организме НАД и НАДФ синтезируются из никотиновой кислоты (ниацина, или витамина РР) или никотинамида, поэтому недостаточность ниацина ведет к нарушению биосинтеза никотинамидных коферментов.

2. Флавиновые КоФ. Флавиновые нуклеотиды (флавинмононуклеотид, ФМН, ; флавинадениндинуклеотид, ФАД, ), являются коферментами так называемых флавопротеинов — ферментов, широко распространенных в живых клетках, принимающих участие в обмене основных классов органических соединений и играющих важную роль в процессе биологического окисления. К флавиновым коферментам относится рибофлавин (витамин В2), недостаточность которого приводит к нарушению нормального функционирования флавинзависимых ферментов

3. КоФ Ацилирования. Кофермент А (КоА, восстановленная форма KoASH; синоним коэнзим А) — соединение аденозин-3',5'-фосфорной кислоты и b-меркаптоэтиламида пантотеновой кислоты, образующее с остатками органических кислот (R) тиоэфиры типа R—СО—SKoA. Играет роль кофермента в переносе и активировании кислотных остатков в реакциях ацилирования, конденсации, оксидоредукции или гидратации органических кислот. КоА участвует в клеточном дыхании, биосинтезе и окислении жирных кислот, синтезе стероидов. Для нормального синтеза КоА необходимо адекватное поступление в организм пантотеновой кислоты, входящей в состав КоА.

НАДФ:

ФАД:

АсСоА:

19. Небелковая часть холофермента. Коферменты, производные витаминов, участие в катализе. Металлоферменты и металлы, как активаторы ферментов.

Коферменты, производные витаминов.

Кофермент В12 (КоВ12, витамин В12) — a-(5,6-диметилбензимидазолил)-кобаламинцианид является коферментом ферментов, участвующих в переносе одноуглеродных фрагментах, обмене метионина и других соединений. Недостаток в рационе витамина В12, вызывающий в организме дефицит кофермента В12, клинически проявляется мегалобластной гиперхромной анемией, ее так называемой нутритивной (алиментарной) В12-дефицитной формой. Эндогенная недостаточность витамина В12 вследствие нарушения всасывания этого витамина в кишечнике также приводит к дефициту кофермента В12, клинически проявляющемуся одной из форм мегалобластной гиперхромной анемии — пернициозной (В12-дефицитной) анемией, или анемией Аддисона — Бирмера. Пиридоксальфосфат и его производные являются простетическими группами ряда ферментов, участвующих в обмене аминокислот (реакциях трансаминирования, декарбоксилирования и др.), а также фермента гликогенфосфорилазы. При недостаточном поступлении в организм пиридоксальфосфата — производного витамина В6 — нарушаются функции пиридоксальзависимых ферментов. Дифосфотиамин является коферментом кетолаз и транскетолаз — ферментов, участвующих в декарбоксилировании a-кетокислот и расщеплении углеродной цепи фосфорилированных сахаров, и представляет собой производное витамина В1 (тиамина).

Металлоферменты или металлоэнзимы — общее собирательное название класса ферментов, для функционирования которых необходимо присутствие катионов тех или иных металлов. Катион металла при этом обеспечивает правильную пространственную конфигурацию активного центра металлофермента, субстрата и 3 и 4ой структур белка.

Zn2+: Карбоангидраза, АДГ, Карбоксипептидаза.

Zn2+, Cu2+ – СОД.

Cu2+ – Металлорудуктазы, Дофамингидроксилаза.

Cu2+, гем как простетич. гр. с Fe2+ – Цитохром С оксидаза.

Mg2+ – Пируваткиназа (ион К+ стабилиз. конф, т.е. трет. стр-ру).

Mn2+. S/T фосфатазы (серин-треониновые), Митохондриальные пептидазы, Малик-фермент.

Se-сод. ферм.: Глутатионпероксидаза, Дейодиназа.

Также есть металлы-активаторы: Mn2+ → гуанилатциклаза; Ca2+, Mg2+ → Ach-эстераза.

20. Классификация и номенклатура ферментов.

1898г.-Эмиль Дюкло – фермент носит название по названию субстрата,который он преобразует,с добавлением окончания –аза.Пример:уреаза(расщепление мочевины),амилаза(расщеплание крахмала).1961г.-номенклатура и классификация:все ферменты разделяются на 6 классов(по типу катализируемых ферментами реакций),каждый класс разделен на подклассы и так далее по тому же принципу,т.е.по типу реакций.таким образом каждый фермент имеет свой шифр(Пример:1.1.3.4.(класс,подкласс,подподкласс,порядковый номер ферменты)-глкокиназа.Ферменту присваивается рациональное(систематическое название)-название субстрата и катализируемых им реакций(названия логичны, но слишком длинные) и рабочие(тривиальные)названия(1.1.3.4.-глюкокиназа).

В основе лежит тип катализируемой реакции. В каждом классе множество подклассов, в зависимости от химич группы субстрата, донора и акцептора преобразуемых группировок и наличия доп молекул. Каждый из 6 классов имет свой порядковый номер. Классы ферментов:

1. Оксидоредуктазы- участвуют в ОВР с 2 субстратами, переносят е или атом водорода с одного субстрата на другой. Подклассы: дегидрогеназ (отщипл водорода с использов акцептора электронов-> НАД+, ФАД, ФМН, НАДФ+); оксидазы (акцептор кислород), оксигеназы (гидроксилазы)- перенос атома кислорода от молекулы кислорода на др вещ-во). 2. Трансферазы- перенос функц групп от одного в-ва к другому. Аминотрансферазы, метилтрансферазы, гликозилтрансферазы, фосфотрансферазы (киназы). 3. Гидролазы- гидролиз. Фосфолипазы, пептидазы, рибонуклеазы- гидролиз вещ-в определенных; эстеразы, фосфатазы- гидролиз определ. хим связи. 4. Лиазы- отщипл гидролитич путем группировку (SH2, NH2, CO2, H2O), либо присоедин. по двойной связи (чаще воду). 5. Изомеразы- катализ различных внутримолек превращений, делятся по типу изомеризации (ОВР, альдозы в кетозы, когда изомеризация состоит во внутримолек переносе группы- мутаза) 6. Синтетазы- катализ образование ковал связи между вещ-ми; если используется энергия АТФ- синтетазы или лигазы, если не АТФ источник, то- синтазы.

Номенклатура ферментов. 1. Тривиальная номенклатура. Пример: пепсин, трипсин. 2. Рабочая номенклатура: название S + тип превращения + окончание «аза». пример: лактатдегидрогеназа. 3. Систематическая номенклатура. Название всех субстратов участвующих в реакции + название класса ферментов. L-лактат: НАД – оксидоредуктаза. 4. Каждый фермент имеет четырехзначный шифр 1.1.1.27 ЛДГ (обозначается класс, подкласс, подподкласс, порядковый номер фермента, соответственно).

21. Механизмы ферментативного катализа. Энергия активации. Образование фермент-субстратного комплекса.

Катализ-ускорение химической реакции,вызванное добавлением малых,нестехиометрических количеств определенного вещества – катализатора.После завершения реакции катализатор обнаруживается в смеси в том же количестве, в каком был добавлен.Катализатор ускоряет реакцию не просто своим присутствием,а взаимодействуя с веществом,подвергающимся превращению.Суть каталитических реакций не столько в том,что скорость их велика(она может быть небольшой),сколько в том, что они заключают в себе циклический процесс,в котором один из реагентов(катализатор)претерпевает попеременные превращения из одной формы в другую,затем снова в первую и т.д.,перерабатывая в каждом цикле по одной молекуле исходного вещества в продукт(пример: SO2+NO2=SO3+NO,NO+1/2O2=NO2и снова NO2 вступает во взаимодействие с SO2 окисляя его.Таким образом NO2-катализатор,окисляет SO2,превращаясь в NO,сам окисляется O2,становясь NO2 и снова может окислять SO2).Подвиды катализа:а) кислотно-основный катализ: многие группы в активном центре фермента могут действовать как кислоты,так и основания. Дает ускорение от 10 до 100 раз (на 1-2 порядка).б)электрофильно-нуклеофильный катализ: электрофильная группа-акцептор электр. связи (ионы металлов), нуклеофильная группа-донор электр.пары(имидазольная группа гистидина,ОН группа сирина,SH группа цистеина).в)ковалентный катализ:нуклеофильная группа вступает в реакции замещения-образование ковалентных промежуточных соединений.Ускоряет реакцию от 100 до 1000 раз(2-3 порядка).

Энергия активации реакций.Скорость реакции определяется ее энергией активации,т.е. той энергией,которую нужно сообщить молекулам, чтобы началось химическое превращение.Чем больше энергия активации,тем меньше скорость реакции.Энергия активации зависит от природы реагирующих молекул,от их внутреннего строения.Источником энергии активации обычно служит тепловое движение молекул(поэтому при повышении температуры скорость реакции увеличивается).Энергия активации быстро протекающих катализируемых реакций ниже,чем энергия активации соответствующих некатализируемых реакций.

На этом основании часто говорят,что катализатор снижает энергию активации реакции(в присутствии катализатора реакцию с высокой энергией активации заменяет реакция с низкой энергией активации).

Образование фермент-субстратного комплекса.(ESкомплекса)Ферментативная реакция начинается с образования промежуточного комплекса фермент-субстрат.Субстрат связан с определенным участком фермента(активным центром-зоной молекулы фермента,которая специфически взаимодействует с субстратом.В активном центре различают участок,ответственный за присоединение субстрата(центр связывания),и каталитический центр,отвечающий за химические превращения субстрата).Связывание субстрата с активным центром происходит в нескольких точках(чем выше специфичность фермента,тем больше точек узнавания),это приводит к деформации субстрата,и,следовательно,к его активации(снижению стабильности).В результате субстрат преобразуется в новый продукт,который утрачивает сродство к активному центру фермента.Снижение или утрата сродства приводит к высвобождению фермента и продуктов реакции.

1)E+S E-S (образование энзим субстратного комплекса),2)E-S E-P (образование комплекса энзим-продукты,возникшее вследствие дестабилизации или активации субстрата).3)E-P  E+P (высвобождение продукта реакции и энзима).

В образовании ES комплекса принимают участие ионные-гидрофобные взаимодействия.Между субстратом и ферментов,как правило,слабые связи.

22. Типы ферментативных реакций. Механизмы 2-х субстратных реакций. Механизм ферментативного действия пиридоксаль-зависимого фермента аланинаминотрансферазы.

1 )Односубстратная: AB= A + B односубстратные 2-хпродуктные; A→B односубстратные однопродуктные (изомеризация)

2)Двусубстратные (большинство): AB↔CD.

В зависимости от последовательности

По механизму протекания

1) Механизм двойного замещения («пинг-понг»)

2) Последовательного замещения

Механизмы ферментативного действия аланиламинотрансфеназы

Общие черты активного центра:

1) А.ц. формируется из участков пептидной цепи и отдельных аминокислотных остатков, содержащих разные функциональные группы. Субстрат, соединяется с активным центром в нескольких точках; это обеспечивает высокую избирательность связывания (комплементарность субстрата и активного центра) и ориентацию субстрата и а.ц.) и ориентацию субстрата, необходимую для катализа реакции.

2) А.ц. как правило располагается в углублении (в нише, в щели) поверхности фермента. В результате субстрат, соединяясь с а.ц., оказывается не в водной среде цитозоля клетки, а в специфическом окружении функциональных групп а.ц.

В ходе присоединения субстрата и в ходе катализа происходят конформационные изменения молекулы фермента и субстрата. До взаимодействия пространственная структура структура субстрата и а.ц. лишь приблизительно соответствовали друг другу; строгая комплементарность возникает в процессе взаимодействия в результате изменений конформации (индуцированное соответствие). Конформационные изменения могут способствовать растягиванию разрываемой связи или, наоборот, сближению молекул при реакциях синтеза и тем самым вносят вклад в ускорение реакции.

23. Кинетика ферментативных реакций. Единицы активности. Измерение скорости реакции. Способы определения активности ферментов.

Скорость ферментативных реакций определяется посредством введения прореагировавших веществ за определенное время при определенных условиях. Измеряют по убыли субстрата S или приросту продукта P за единицу времени. Зависит от активности фермента. Активность фермента выражается в ед. ферментативной активности. Каталитическая активность фермента катализирует 1 моль субстрата за 1 сек. Моль/сек (кат). Хмкмоль/сек*л – Х мкмлоь субстрата, преобразованные в 1 л. За 1 сек. E=ME+мкмоль/мин.

Активность ЛДГ. 120 U/L 1мкат/л=60 U/L Xмкат/л= 120 U/L. Удельная активность фермента

Молекулярная активность фермента.

В образце содержится 0,0014 мкмоль ацетилхолинэсткразы, активность 420 мкмоль/сек. Мол акт = (420 МКМОЛЬ/МИН)/ 0,0014мкмоль= 300000мин-1. Указывает сколько молекул субстрата превращается 1 молекулой фермента за 1 мин. Измерение скорости ферм. Акт по убыли субстрата.

Порядок реакции определяется характером ее зависимости от концентарции субстрата.

П ОРЯДОК РЕАКЦИИ по данному в-ву, показатель степени при концентрации этого в-ва в кинетич.. ур-нии р-ции. Согласно действующих масс закону, скорость у простой (одностадийной) р-ции между в-ми А и В.

24. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН, температуры, концентрации фермента, субстрата. Порядок реакции. Константа Михаэлиса и способы её определения.

Линейная зависимость