ЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕН
Электрофорез – перемещение заряженных молекул под действием электрического поля к катоду или аноду в зависимости от знака их суммарного заряда.
Скорость движения идеализированной
сферической частицы в электрическом поле
v zE
6 r
z - заряд частицы E - напряженность электрического поля- вязкость среды
r- радиус частицы
Скорость движения частиц (см/мин) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью. Она имеет размерность см2·мин-1·В-1, а ее знак совпадает со знаком суммарного заряда. Различия в подвижности частиц служит основой для разделения смесей методом электрофореза.
Гель-электрофорез
Использование гелей в качестве поддерживающей
среды позволяет стабилизировать электрофоретические зоны и обеспечивает эффект
Полиакриламидный гель
Акриламид – мономер, формирующий
линейные цепи
N,N’- метиленбисакрилами д – поперечно- сшивающий мономер
Т = 5-15% С = 2-5%
(CH3)2N-CH2-CH2-N(CH3)2
ТЕМЕД – катализатор
(N,N,N’,N'- тетраметилэтилендиами
(NH4)2S2O8
Персульфат аммония – инициатор полимеризации
Агарозный гель
Агароза – полисахарид. Ее элементарным звеном служит дисахарид агаробиоза, в состав которого входит необычный сахар – 3,6- ангидро-L-галактоза.
Структура и формирование агарозного геля
Scanning EM image of agarose polymer
Заливка горячего |
Установка |
раствора агарозы |
«гребенки» |
в форму |
|
Агарозный и полиакриламидный гели
В агарозном геле |
В полиакриламидном геле |
формируются нековалентные |
полимерные цепи связаны |
водородные и гидрофобные |
ковалентными поперечными |
связи между протяженными |
сшивками (•) |
полисахаридными нитями |
|
Вертикальный и горизонтальный электрофорез
Вертикальный электрофорез
Формирование карманов и загрузка образцов
Изоэлектрическое фокусирование
отвечающих следующим требованиям:
•отсутствие взаимодействия с белками,
•низкая молекулярная масса,
•наименьшее возможное различие между рК и pI,
•хорошая электропроводность,
•наименьшее возможное поглощение света в области УФ-поглощения белков,
•равномерное распределение зон pI амфолитов,
•Коммерческиемаксимальное количество различных ИЭФзначений– рI. амфолиты для
смесь низкомолекулярных
полиаминополикарбоновых
В настоящее время для ИЭФ наиболее широко используются так называемые
еление белков по размера с использованием
За счет гидрофобных взаимодействий додецилсульфат натрия (SDS, ДС-Na) примерно одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении около 1,4 мг ДС-Na на мг белка
Белки, обработанные ДС-Na, обладают одинаковым отношением масса/заряд и их подвижность при ЭФ в поддерживающей среде с эффектом молекулярного сита зависит только от размера молекулы.
Определение молекулярной массы белков при помощи SDS-электрофореза