Диализ и ультрафильтрация
N2 pressure
При началеПри достижении диализа равновесия
Диализ и ультрафильтрация – методы фракционирования, основанные на использовании полупроницаемых мембран.
ЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКО
СВОЙСТВО
БЕЛКА
ЗАРЯД
ГИДРОФОБНО
СТЬ/ГИДРОФИ
ЛЬНОСТЬ
РАЗМЕР
МЕТОД РАЗДЕЛЕНИЯ
ХРОМАТОГРАФИ |
ЭЛЕКТОФОРЕ |
ДРУГОЕ |
Я |
З |
|
ИОНООБМЕННАЯ |
ИЗОЭЛЕКТРОФ |
(ИОХ, IEX) |
ОКУ- |
[АФФИННАЯ (АХ, |
СИРОВАНИЕ |
AC)] |
(ИЭФ, IEF) |
ГИДРОФОБНАЯ |
|
(ГХ, HIC) |
|
ОБРАЩЕННО |
|
ФАЗОВАЯ (ОФХ, |
|
RPC) |
|
[АФФИННАЯ (АХ, |
|
AC)] |
|
ГЕЛЬПРОНИКАЮЩ |
С |
АЯ |
ДОДЕЦИЛСУЛЬ- |
(ЭКСКЛЮЗИОННАЯ |
ФАТОМ НАТРИЯ |
, ГПХ, SEC) |
(SDS-PAGE) |
ИЗОЭЛЕКТРИЧЕС КОЕ ОСАЖДЕНИЕ
ВЫСАЛИВАНИЕ,
ОСАЖДЕНИЕ
ОРГАНИЧЕСКИМИ
РАСТВОРИТЕЛЯМ
И
ДИАЛИЗ,
УЛЬТРАФИЛЬТРА
ЦИЯ,
ЦЕНТРИФУГИРОВ А-НИЕ
СТРАТЕГИЯ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ
Подготовка «Захват» Промежуточная «Полировка» очистка
ОСОБЕННОСТИ МЕТОДОВ РОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ СПОЛЬЗОВАНИИ ИХ ДЛЯ ОЧИСТКЕ БЕ
МЕЖДУ ЧЕТЫРЕХ ОГНЕЙ
РАЗРЕШЕНИЕ
СКОРОСТЬ |
НАГРУЗКА |
ВЫХОД
|
Исходный материал |
Анализ |
|
||
|
Гомогенизация, осветление |
|
Центрифугирование |
||
|
|
Фильтрация |
|||
|
|
|
|
|
|
|
Экстракт |
|
Анализ |
|
|
|
Концентрирование |
|
Ультрафильтрация |
||
|
|
Осаждение |
|||
Концентрированный экстракт |
Анализ |
Электрофорез(ИЭФ) |
|||
Препаративное фракционирование |
|
(ИОХ,ГПХ,ГХ,ОФХ,АХ) |
|||
|
Хроматография |
||||
|
|
|
|
|
Ультрафильтрация |
Фр. 1 |
Фр. 2 |
… |
Фр. N |
Анализ |
Осаждение |
|
|||||
|
Активная фракция |
|
(SDS-ПААГЭ,ИЭФ) |
||
|
|
|
|
|
|
Аналитическое фракционирование |
|
Электрофорез |
|||
|
(ГПХ,ОФХ) |
||||
|
|
|
|
|
|
НЕТ |
|
|
|
|
Хроматография |
Белок чистый? |
|
|
|
||
|
|
|
|
||
|
|
КонецДА |
СХЕМА ОЧИСТКИ БЕЛКО |
||
ТКА РЕКОМБИНАНТНЫХ ВАРИАНТОВ ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИ
BIGEP |
Purification |
Total |
Amount of |
Yield, |
Purification |
form |
stage |
protein, mg |
protein of |
% |
rate |
|
|
|
interest, % |
|
|
SPM |
IB solution |
10 |
34 |
100 |
1.0 |
|
IEC |
3 |
80 |
70 |
2.4 |
|
GPC |
1.5 |
100 |
44 |
2.9 |
PM |
IB solution |
16 |
72 |
100 |
1.0 |
|
IEC |
7.5 |
89 |
58 |
1.2 |
|
GPC |
5 |
100 |
43 |
1.4 |
PEM |
IB solution |
15 |
77 |
100 |
1.0 |
|
IEC |
7.2 |
92 |
58 |
1.2 |
|
GPC |
5.5 |
100 |
48 |
1.3 |
M |
IB solution |
18 |
86 |
100 |
1.0 |
|
IEC |
8 |
95 |
49 |
1.1 |
|
GPC |
7 |
100 |
45 |
1.2 |
ТЕЛЬЦА ВКЛЮЧЕНИЯ
чистка металлопротеазы термоактиномицет
Purification stages |
Total |
protein |
|
|
(mg) |
E. coli cell lysate |
168,0 |
Anion exchange |
21,1 |
chromatography on |
|
Econo-Pac High Q column |
|
Hydrophobic interaction |
6,0 |
chromatography on Phenyl |
|
Sepharose CL-4B |
|
Size exclusion |
4,1 |
chromatography on |
|
Superdex 75 HR column |
|
Proteolyt ic activity (U/mg)
8,3
29,3
37,3
41,0
Yield by activity
(%)
100,0
44,2
15,9
12,1
Purifi- catio n rate
1,0
3,5
4,5
4,9
Вопросы для
самоподготовки• Структурная организация белков: общие положения.
•Хроматографические методы разделения: обращенно-фазовая, гидрофобная, ионообменная, гельпроникающая и аффинная хроматография.
•Электрофоретические методы разделения: изоэлектрофокусирование и SDS- электрофорез.
•Центрифугирование, разделение
осаждением, диализ и