. Лиганды для протеаз
протеаз могут служить главным образом аналоги субстратов и ингибиторы. Коммерчески доступны сорбенты для протеаз несущие в качестве лигандов
аминокислоты и пептиды (аргинин, триптофан, Аla-Ala-Ala), аналоги субстратов (Gly-Tyr-азобензилянтарная кислота), синтетические и природные ингибиторы трипсина (п-аминобензамидин) и химотрипсина, ингибитор кислых протеиназ пепстатин, природные антибиотики
6. Олиго(dT) и полиуридировая кислота
на своем 3'-конце более или менее протяженную полиадениновую последовательность (средняя длина – около 100 адениловых остатков). Это обстоятельство дало возможность создать аффинный сорбент с групповой специфичностью к любой молекуле мРНК, содержащей такую последовательность. На матрице закрепляют комплементарный гомополимер олиго(U) или олиго(dT) длиной около 100 остатков. Наиболее распространённый сегодня коммерческий сорбент Oligo(dT)- Cellulose (GE Helthcare, NEB,
Металлохелат аффинная хроматография
Л Men+ |
Y + XБ |
Л Men+ |
XБ +Y |
– хелатообразующий стационарный лиганд еn+ – ион металла
–обмениваемый подвижный лиганд
Б– белок с электронодонорной координирующей группо
Металлохелат аффинная хроматография
Cтационарные
Нитрилотриуксусная кислота |
Иминодиуксусная кислота |
(НТК, NTA) |
(ИДК, IDA) |
Металлы: Cu2+, Ni2+, Fe3+, Co2+, Zn2+
Основной вклад в связывание белка вносят остатки
His.
Стандартным подходом является введение в
рекомбинантные белки гистидиновых (чаще всего His6) последовательностей (якорей, тагов) для
упрощения процедуры очистки
Вклад в связывание вносят также остатки Cys и
Методы элюции |
Method 1 |
|
The simplest case. A change of |
|
buffer composition elutes the |
|
bound substance without |
|
harming either it or the ligand. |
Method 2
Extremes of pH or high concentrations of chaotropic agents are required for elution, but these may cause permanent or temporary damage.
Methods 3 and 4
Specific elution by addition of a substance that competes for binding. These methods can enhance the specificity of media that use group-specific ligands.
ЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКО
СВОЙСТВО
БЕЛКА
ЗАРЯД
ГИДРОФОБНО
СТЬ/ГИДРОФИ
ЛЬНОСТЬ
РАЗМЕР
МЕТОД РАЗДЕЛЕНИЯ
ХРОМАТОГРАФИ
Я
ИОНООБМЕННАЯ (ИОХ, IEX) [АФФИННАЯ (АХ, AC)]
ГИДРОФОБНАЯ (ГХ, HIC) ОБРАЩЕННО ФАЗОВАЯ (ОФХ, RPC) [АФФИННАЯ (АХ, AC)]
ГЕЛЬПРОНИКАЮЩ
АЯ
(ЭКСКЛЮЗИОННАЯ , ГПХ, SEC)
ЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕН
Электрофорез – перемещение заряженных молекул под действием электрического поля к катоду или аноду в зависимости от знака их суммарного заряда.
Скорость движения идеализированной
сферической частицы в электрическом поле
v zE
6 r
z - заряд частицы E - напряженность электрического поля- вязкость среды
r- радиус частицы
Скорость движения частиц (см/мин) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью. Она имеет размерность см2·мин-1·В-1, а ее знак совпадает со знаком суммарного заряда. Различия в подвижности частиц служит основой для разделения смесей методом электрофореза.
Гель-электрофорез
Использование гелей в качестве поддерживающей
среды позволяет стабилизировать электрофоретические зоны и обеспечивает эффект
Полиакриламидный гель
Акриламид – мономер, формирующий
линейные цепи
N,N’- метиленбисакрилами д – поперечно- сшивающий мономер
Т = 5-15% С = 2-5%
(CH3)2N-CH2-CH2-N(CH3)2
ТЕМЕД – катализатор
(N,N,N’,N'- тетраметилэтилендиами
(NH4)2S2O8
Персульфат аммония – инициатор полимеризации