11. Методы диагностики вирусных инфекций: быстрые и ретроспективные методы.

Методы диагностики вирусных инфекций 1. Цитологический (быстрая диагностика); 2. Вирусологический 3. Серологический 4. Молекулярно-генетический

Методы быстрой диагностики  Экспресс-методы;  Ускоренные методы;

Экспресс-методы диагностики вирусных инфекций Малоспецифические ♦ Внутриклеточные включения • тельца Пашена (цитоплазматические включения со светлым ободком – натуральная оспа) • тельца Арагана (цитоплазматические включения – ветряная оспа) • Тельца Бабеша-Негри (цитоплазматические включения - бешенство) • ядерные включения (напр. при аденовирусной инфекции)

♦ Выявление вириона в пробах •ЭМ (дает ответ в течение 1 часа); •ЭИМ (дает ответ в течение 2-3 часов); Подходят для рота, адено, гепадна, парамиксо, ортомиксовирусов и др.

Высокоспецифические  Выявление вирусного АГ в пробах: РИФ, ИФА, РНГА, РИА, реакция преципитации в геле (от 2 до 24 часов);  Выявление ранних противовирусных АТ IgM: РНГА, РОНГА, ИФА, РИА и др.;  Выявление вирусных ферментов в тесте МГ;  Выявление НК: ПЦР;

Ускоренные методы Выявление вирусного АГ в клеточной культуре через 24 после накопления.

Ретроспективные методы  Вирусологический метод;  Серодиагностика;

Вирусологический метод Этапы:  Культивирование (накопление) вируса (куриный эмбрион, организм чувствительного лабораторного животного, клеточные культуры);  Индикация (обнаружение) вируса (РГА, РГАдс, ЦПД, образование бляшек и др.);  Типирование (идентификация вируса) (РСК, РТГА, РНГА, ИФА);

Серодиагностика  Необходимо 4х кратное нарастание титра АТ.

46. Серологические реакции, применяемые в вирусологии. Механизм ртга (реакция торможения гемагглютинации), рбн (реакция биологической нейтрализации методом цветной пробы и др.), рнга, ифа, рск.

Все серологичные реакции используются с двоякой целью:

1) для выявления антител в сыворотке больного с помощью стандартных антигенов-диагностикумов – для серологической диагностики инфекционной болезни;

2) для определения неизвестных антигенов (бактерий, грибов, вирусов) за известными стандартными сыворотками-антителами – для серологической идентификации возбудителей.

РТГА: Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке (лунке) смешивают равные объемы сыворотки крови и вируса и после экспозиции (30—40 мин) добавляют эритроциты соответствующего вида животного.

Выбор эритроцитов зависит от вируса, используемого в РТГА. Так, для вирусов гриппа используют эритроциты кур, для ПГ-3 КРС — эритроциты морской свинки. Обычно используют 0,5—1%-ную взвесь эритроцитов

Эритроциты являются индикатором наличия вируса в смеси. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие вируса в смеси, а отсутствие гемагглютинации — на его отсутствие, так как антитела полностью нейтрализовали гемагглютинирующую активность вируса.

РБН: В РБН берут или двукратно возрастающие разведения исследуемых сывороток и постоянную дозу вируса, или одно (постоянное) разведение сывороток и 10-кратно возрастающие разведения препарата вируса. Реакция (РБН) применяется для определения вируснейтрализующей активности сывороток и носоглоточных смывов. Она высокочувствительна и штаммоспецифична, требует значительных затрат времени. Принцип метода основан на способности специфических антител сывороток крови или секрета дыхательных путей соединяться с соответствующим по антигенной структуре вирусом гриппа.

РНГА: В РНГА выявляют антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами. Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки.

ИФА: это лабораторное исследование, основанное на реакции «антиген-антитело». Суть этого лабораторного метода - выявление специфических антител с помощью специальных биохимических реакций, которые помогают определить присутствие или отсутствие антител и их количество. Методом ИФА можно определить уровень гормонов, иммуноглобулинов, иммунологических комплексов и других биологически активных веществ. Материалом для исследования может служить кровь (ИФА крови), спинномозговая жидкость, содержимое стекловидного тела, околоплодные воды и т.д. Метод иммуноферментного анализа используется для определения наличия антигенов возбудителей различных инфекций и для определения наличия антител классов (IgA, IgM, IgG) к антигенам различных возбудителей (вирусные гепатиты, ВИЧ, сифилис, TORCH, хламидиозы, паразитозы). Недостаток - относясь к непрямым методам диагностики, он позволяет определить иммунный ответ организма на возбудителя, а не самого возбудителя.

РСК: заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), те происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, то комплемент остается свободным. PCK проводят в две фазы 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним.

ПЦР- диагностика вирусных инфекций - экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов. Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.).