Методы выделения днк и рнк
Цель экстракции:
-Удаление белков , ДНК или РНК
- Изоляция специфического типа ДНК (или РНК)
Основные требования:
- Низкая трудоемкость
-Быстрота выполнения процедуры
-Максимальное удаление ингибиторов ПЦР
-Минимизация потерь нуклеиновых кислот
- Низкий риск перекрестной контаминации «от образца к образцу»
Способы выделения зависят от вида исследуемого материала , от его природы ,характера
и свойств выделяемого объекта.
3 этапа:
Разрушение клеток (лизис)
Кипячение ,использование хаотропных агентов.
Инактивация нуклеаз
Очистка нуклеиновых кислот
Возможна дополнительная обработка ферментами:протеазами ,РНК-азами.
Типы методов:
По дифференциальной растворимости
Адсорбционные методы
В градиентной плотности при центрифугировании
Один из популярных методов выделения ДНК основан на использовании для лизиса сильного хаотропного агента – гуанидинатиоцианата и последующей сорбции ДНК
на носителе.
Гуанидинтиоцианат-очень сильный денатурирующий агент ,который используется для
одновременного лизиса клеток и денатурации всех клеточных белков (в том числе РНК-аз)
После серии отмывок в пробе остается ДНК ,сорбированная на носителе , с которого она
хорошо снимается с помощью элюирующего буфера.
+ : - Удобный и технологичный метод
- : -Потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе и в процессе отмывок.
- Следовые количества гуанидинатиоцианата могут ингибировать амплификацию.
С целью усовершенствования методики:
-Лизис клеток гуанидиномтиоцианатомс последующей сорбцией на частицах двуокиси
кремния.
- Лизис клеток гуанидинтиоцианатом с последующим высаживанием изопропаноломс
последующими отмывками и элюцией.
Следует отметить ,что:
РНК более лабильна ,чем ДНК ,а РНК-азы более устойчивы к денатурации,чем ДНК-азы. , что затрудняет получение полноразмерной РНК.
Группа методов ,основанная на использовании афинных ионообменников типа Chilex:
Сорбент с низкой емкостью ,в отличие от стекла , сорбирует не ДНК ,а примеси.
2 Стадии:
- Кипячение образца на термошейкере в результате чего клеточные стенки разрушаются или лизис с детергентами , не ингибирующими ПЦР , нуклеиновые кислоты выходят в раствор.
- Сорбция примесей на ионообменнике.
Методы выделения нуклеиновых кислот постоянно совершенствуются в сторону уменьше-
ния количества манипуляций и в идеале должны состоять из одной или двух процедур.
Эффективность выделения ДНК и особенно РНК повышается , если использовать специаль-
ные приборы-риболайзеры.
Преимущества:
-Увеличение производительности
-Сокращение времени
-Снижение риска перекрестной контаминации
-Стандартизация процесса нуклеовыделения
-Снижение вероятности появления ошибок в работе оператора.
Используют колонки (картриджи) ,заполненные сорбентом ДНК (промывка и элюция ДНК
осуществляется проточным способом или центрифугированием) , магнитными сорбентами ,
связывающие нуклеиновые кислоты различными способами или связывающие поверхност-ные белки клеточных мембран.
В автоматических системах используют пробирочный и планшетный форматы выделения нуклеиновых кислот.
Ручные операции сведены к загрузке образцов , реактивов и расходных материалов в экстрактор.