Недостатки пцр-диагностики:
- Высокая стоимость оборудования
-Одновременная амплификация ДНК как живого , так и погибшего м/о ,
элиминация возбудителя не ранее 4-8 недель
-Возможность перекрестной реакции
- Получение ложноотрицательных результатов при наличии ингибиторов ПЦР.
- Определенная техническая подготовка персонала.
- Вероятность контаминации:
А) Перекрестной контаминации от пробы к пробе , возникающая в процессе обработки образцов или при раскапывании реакционной смеси.
Б) Контаминация продуктами амплификации (ампликонами)
Преимущества ПЦР в реальном времени:
Амплификация и детекция проходят одновременно в закрытых пробирках ,что
снижает риск контаминации образцов.
Мониторинг и количественный анализ накопления продуктов ПЦР.
Возможность определения геномэквивалентов /мл образца.
Автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.
Не требует стадии электрофореза,что позволяет снизить требования ,
, что позволяет снизить требования ,предъявляемые к ПЦР-лаборатории.
Высокая производительность ,особенно при использовании автоматического
нуклеовыделения и готовых реакционных смесей (ГРС)
Высокая чувствительность метода , в 2-3 раза выше детекции методом электрофореза.
Широкий спектр наборов для данного типа детекции:
- Для диагностики ИППП и дисбиозов урогенитального тракта(Флороценоз)
- Для диагностики ОКИ
-Для диагностики ОРВИ
-Для диагностики клещевых инфекций
-Для диагностики герпесвирусных инфекций
-Для диагностики вирусных инфекций-краснухи ,парвовирусной В19 инфекции
- Для диагностики коклюша ,респираторного микоплазмоза и хламидофилеза.
- Для диагностики бактериальныхнейроинфекций
- Для диагностики ВПЧ-инфекции
- Для диагностики туберкулеза
-Для диагностики лептоспироза.
Генетическое секвенирование-расшифровка всей генетической последовательности
НК.
Золотой стандарт видовой идентификации микроорганизмов.
Организация ПЦР-лаборатории.
Способность ПЦР нарабатывать ДНК даже с единственной подходящей матричной молекулы накладывает определенные условия на организацию лаборатории.
Если лабораторное оборудование или реактивы будут загрязнены продуктами преды-
дущих реакций , это может привести к получению некорректных результатов в после-
дующих ПЦР-исследованиях с теми же праймерами.
Требования к работе с ПЦР изложены в
МУ 1.3.2569-09 «Организация лабораторий ,использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом , содержащим микрорганизмыI-IV групп патогенности»
Должен соблюдаться ряд требований:
Организация отдельных помещений для разных этапов ПЦР-анализа:
- Зона разбора и пробоподготовки исследуемого материала
- Зона очистки нуклеиновыых кислот
-Зона проведения амплификации
-Зона учета продуктов амплификации
Для флуоресцентных методик зона амплификации объединена с зоной учета
продуктов ПЦР-анализа.
Для электрофоретического метода учет продуктов амплификации проводится
в отдельном помещении с автономной системой вентиляции.
Каждый из указанных выше этапов должен осуществляться отдельным набором
автоматических пипеток и с использованием одноразовых расходных материалов
(наконечников , пипеток).
Желательно использовать наконечники и пробирки с маркировкой «DNAseandRNA
se free»
Желательно , чтобы наконечники для пипеток были с аэрозольными фильтрами
(aerosol-resistant tips)
Каждый из процессов (очистка ДНК ,проведение реакций и ,если требуется нанесе-
ние образцов в гель после реакции) необходимо выполнять в новых одноразовых
перчатках (без талька)
Необходимо избегать перемещения оборудования или реактивов из одного помеще-
ния в другое. (особенно из электрофоретической комнаты в другие комнаты)
Желательно проводить этапы приготовления реакций и электрофорез силами разных
сотрудников , а при выполнении всех этапов одним сотрудником , желательно про-
водить гель-электрофорез в конце рабочего дня , чтобы после электрофоретической
комнаты не заходить в комнаты для очистки ДНК и проведения амплификации.
Очистку ДНК и приготовление реакций желательно проводить в ПЦР-боксах ( или
в ламинарах с выключенным воздушным потоком , поскольку воздушный поток по-
вышает вероятность кросс-контаминации образцов ) с УФ-лампами , которые небхо
димо включать на ночь.
Необходимо включать в экспериментальную постановку контрольные реакции:
- ОКО –отрицательный контрольный образец (не содержит матричную ДНК).
наличие продуктов амплификации в ОКО свидетельствует о загрязнении оборудо-
вания или реактивов продуктами ПЦР предыдущих исследований.
- ПКО – положительный контрольный образец , в котором реакция должна пройти
обязательно.Отсутствие результата в ПКО свидетельствует об ошибках в приготов-
лении реакции или испорченных реактивах.
- ВКО- внутренний контрольный образец , свидетельствует о качестве проведения
этапа очистки (экстракции , выделения) нуклеиновых кислот (ДНК/РНК).