Особенности генетики микроорганизмов (бактерий)

- наука о закономерностях наследственности и изменчивости микроорганизмов.

Наследственность – способность передавать признаки и свойства м/о от одних поколений

другим.

Единица наследственности – ген

Ген –участок молекулы нуклеиновой кислоты (как правило ДНК/у бактерий/ , РНК /у некото

рых вирусов/ , несущий информацию о специфической структуре 1 белка.

Нуклеиновые кислоты – линейные биополимеры ,состоящие из мономеров-нуклеотидов.

Геном – совокупность генов нуклоида.

Генотип – совокупность генов нуклеоида и плазмид.

У всех живых микроорганизмов 2 типа нуклеиновых кислот:

1. Днк (Дезоксирибонуклеиновая кислота)

-длинная 2-цепочечная молекула ,закрученная в спираль. Универсальный носитель генетической информации , которая записана с помощью генетического кода азотис-

тых оснований (аденин ,гуанин ,цитозин и тимин /А,Г ,Ц,Т/ )

Представляет собой биополимер, который состоит из нуклеотидов.

ДНК имеет первичную и вторичную структуру:

а) Первичная стуктура – линейная последовательность нуклеотидов.

Нуклеотид состоит в свою очередь из одного из азотистых оснований ,дезоксирибозы и остатка фосфорной кислоты.

б) Вторичная структура – это 2 комплементарные нити ДНК ,закрученные в двойную

спираль.

Эти нити комплементарны и антипараллельны.

Свойства ДНК:

А) Уникальная способность к cамовоспроизведению-репликации.

-способность к построению второй комплементарной цепи на матрице 1 из цепей.

Т.о. на матричной цепи строится дочерняя по принципу комплементарности при

помощи фермента ДНК-зависимой ДНК-полимеразы.

Б) Принцип комплементарности

Напротив Аденина в одной цепи в другой цепи всегда стоит Тимин

Напротив Гуанина в одной цепи в другой цепи расположен Цитозин.

Таким образом дочерняя нить ДНК является зеркальным отображением материнс-

кой (матричной ) ДНК

В) Способность к денатурации при 95⁰С .

Денатурация –потеря вторичной структуры ДНК ,проявляющаяся в расхождении

2-х цепей . При понижении температуры ДНК восстанавливает свою двойную спи-

раль.

Г) Антипараллельность двух нитей ДНК : 1 нить – 3^’-5^’

2 нить –5^’-3^’

Принцип строения ДНК универсален для всего живого,но у разных видов ДНК

отличается по длине , по составу и последовательности оснований нуклеотидов.

Функция: Хранение ,воспроизведение и передача генетической информации.

Вся генетическая информация уникальна и не повторяется.

Реализация в течение всей жизни клетки в виде синтеза белков.

Перед синтезом белка двойная спираль ДНК раскручивается и ее нити расходятся ,на

одной из нитей ДНК(матричной) происходит синтез информационной РНК (транскрипция)

2. РНК (Рибонуклеиновая кислота)

Отличия от ДНК:

- Имеет только первичную структуру – линейная последовательность нуклеотидов.

- В составе нуклеотида вместо дезоксирибозы-рибоза.

- Также состоит из 4 азотистых оснований , но взамен тимина-урацил:

А- У

Г- Ц

- РНК в отличие от ДНК – короткоживущий компонент клетки , выявление рРНК

методом NASBA-ПЦР позволяет выявить жизнеспособныевозбулители.

-У бактерий 3 типа РНК:

• информационная РНК

«Информационный посредник» между ДНК нуклеоида и рибосомой.

• транспортная РНК

В процессе синтеза белка поставляет аминокислоты к рибосомам согласно

информации ,записанной на информационной РНК.

• рибосомальная РНК.

Входит в состав рибосом-органоидов,на которых происходит синтез белка из

отдельных аминокислот по заданной иРНК матрице.(программе)- трансляция.

-У вирусов 2 типа РНК: геномная +РНК и геномная - РНК

+РНК является информационной РНК и напрямую участвует в синтезе белка.

- РНК не является информационной РНК , на ее матрице синтезируется копия ДНК

при помощи фермента обратной транскриптазы (ревертазы) .

Для большинства вирусов РНК выполняет функцию хранения генетической информации взамен ДНК.

Схема реализации генетического кода:

Ген (ДНК) -^{транскрипция}-РНК -^{трансляция}--белок (фермент/структурный белок) ------признак (наличие жгутика ,токсина ,адгезинов)

Особенности генетики бактерий:

-1 кольцевиднозамкнутая 2-х цепочечная молекула ДНК (нуклеоид)/1 «хромосома»/

- ДНК бактерий имеет только первичную и вторичную структуру ,в отличие

от эукариот ,у которых имеется третичная структура.

-Все гены находятся в постоянной активности на 95%( у эукариот 10% генов)

- Наличие внехромосомных ДНК –плазмид , которые могут передаваться от одной клетке к другой в процессе конъюгации( Плазмиды вирулентности , R-плазмиды) .Могут находится свободно (неактивны) и быть встроенными хромосому-эписома (активны).

- Наличие трех типов РНК как и эукариот (иРНК ,тРНК ,рРНК)

Практическое применение.

Уникальные свойства нуклеиновых кислот , а именно способность к репликации ,

денатурации и восстановлению своей вторичной структуры , транскрипции и тран-

сляции легли в основу разработок молекулярно-генетических методов диагностики

заболеваний человека , в том числе инфекционного генеза.

Генетические (Молекулярно-биологические) методы

диагностики инфекционных заболеваний.

Основаны на обнаружении нуклеиновых кислот(ДНК, геномной РНК , рибосомальной РНК) возбудителя (бактерий,вирусов ,простейших) в пробе.

Генетические методы:

1. Гибридизационные

2. Амплификационные методы:

- ПЦР (полимеразная цепная реакция)

- Лигазная реакция

- Методы транскрипционно-опосредованной амплификации (NASBAПЦР)

Основной и наиболее распространенный метод-ПЦР(Полимеразная цепная реакция)

Основа реакции- способность ДНК к самопроизведению.

Позволяет увеличить число копий искомого специфического участка ДНК бактерий и вирусов в миллионы раз с использованием ДНК-полимеразы,нуклеотидов ,праймеров ,буфера и специального оборудования(амплификатора)

1. Пробоподготовка исследуемого материала:

-центрифугирование (кровь ,моча ,ликвор ,фекалии)

-гомогенизация

2. Экстракция нуклеиновых кислот (Нуклеовыделение) ДНК , РНК ,рибосомальнойРНК:

Разрушение оболочек эпителиальных клеток ,оболочек бактерий и вирусов ,уда-

ление белков ,ингибиторов ПЦР (белки , ДНК-аза) с последующим осаждением

и элюцией нуклеиновых кислот в раствор.

- Термолизис (Экспресс-метод ,ведущий к потери части ДНК ,не подходит для

выделения РНК)

-Осаждение

-Осаждение с магнитным штативом.

При любом способе нуклеовыделение проводится в присутствии ВКО-внутренне-

го контрольного образца (ген глобина человека ,который добавляется в пробирку)

Нуклеовыделение проводится в пробирках с применением хаотропных агентов ,осадителей ,отмывочных растворов и элюирующих растворов.

Нуклеовыделение от 15 мин до 2 часов ,в зависимости от количества образцов и

способа экстракции. Проводится вручную или автоматически (пр «EasyMaq»)

3) Амплификация- многократное увеличение числа копий специфического участка

ДНК.

Амплификация проводится на специальных приборах-амплификаторах(термоцик-

лерах) и амплификаторах с детекцией флуоресцентного сигнала.

Данные приборы позволяют резко изменять температуру согласно протоколу иссле-

дования:

2 типа приборов:

а) Планшетного типа (СFX-96 , ICyqler 5)

б) Роторного типа (RottorGen)

Компоненты реакции ПЦР:

1. Искомая ДНК образца(хромосомная ,плазмидная) ,или РНК (геномная ,рибосо -мальная),

2. Праймеры-олигонуклеотиды (10-30 азотистых оснований),содержащие компле-

ментарную последовательность ДНК к границе специфического участка искомой

ДНК.

При отсутсвии такого участка праймер не прикрепится и ПЦР не начнется.

3. Термостабильная ДНК-зависимая ДНК-полимераза (TaqF)

Данный фермент выдерживает колебания высоких температур на всех этапах

амплификации.Активный синтез копий ДНК при температуре 70-72⁰С.

4. Cмесь нуклеотидов с различными азотистыми основаниями.(А,Г,Ц,Т)

Из нуклеотидов фермент ДНК-полимераза синтезирует копию ДНК.

5. Олигоуклеотиды-зонды,меченыефлуорофорами (FAM , HEXи пр.) и гасите-

лем .Только для варианта ПЦР в реальном времени (Real-TimePCR)

6. Cолевой буферный раствор.

Cодержит соли магния для работы полимеразы.

7. Ревертаза (Обратная транскриптаза) –только ПЦР-диагностики вирусных

инфекций ,вызванных РНК-содержащими вирусами.

РНК не амплифицируется. Для ее обнаружения необходимо провести процесс

обратной транскрипции : на матрице РНК синтезируется копия ДНК (кДНК) ,

которая потом используется для амплификации.

Обратная транскрипция проводится либо предварительно в пробирке после этапа нуклеовыделения , либо непосредственно в амплификаторе при 50⁰С после ну-

клеовыделения и сборки ПЦР-смеси.

Такая ПЦР называется – ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией)

8. Минеральное масло-используется для предотвращения испарения ПЦР-смеси

во время амплификации.

Варианты ПЦР-смесей:

- ПЦР-смеси ,которые неоходимо готовить из ,как правило,замороженных компонентов при

в отдельной стерильной микропробирке объемом 1,5-2 мл при каждой постановке ПЦР.

- Полуготовые ПЦР-смеси в отдельных микропробирках объемом 0,2 ,0,5 мл.,раскапанные

под воск ,которые требуют добавления смеси нуклеотидов на поверхность воска.

- Готовые лиофильно высушенные реакционные смеси (ГРС) в стрипованных или отдель

ныхмикропробирках – вся продукция ЗАО «ВекторБест» серии «РеалБест»

ПЦР проводится с использованием тонкостенных или толстостенных микропробирок с

выпуклыми/плоскими крышками ,изготовленных из ДНК-аза /РНК-аза fre пластика.

Смесь раскапывется в определенном объеме или отбирается необходимое количество

микропробирок с готовой смесью и вносятся образцы с выделенной ДНК(РНК).

Объём реакционной смеси составляет от 0,25 до 0,5 мкл.

Постановка контрольных реакций ОКО и ПКО.

Этапы собственно ПЦР-амплификации:

• Денатурация(«плавление»)ДНК( при 93⁰-95⁰С) 30 с.- 2 мин.

Расплетений двойной спирали и расхождение цепей.

• Присоединение специфических праймеров(отжиг)(62⁰С) 30 с. – 2 мин.

Праймеры должны быть комплементарны специфическому участку искомой

ДНК. С места прикрепления праймера начнется синтез копии нити ДНК

ферментом полимеразой.

• Синтез ДНК ДНК-полимеразой(72⁰С) – элонгация -1 мин.

Достраивание дочерней нити ДНК по принципу комплементарности из присутствующих в реакционной смеси нуклеотидов с различными азотистыми основаниями.

1-й цикл-удлинение участка дочерней цепи,начиная от праймера, происходит произвольно , т.к. используемая полимераза не способна синтезировать про-

должительный участок. Образование побочных продуктов.

2-й цикл - в растворе образуются ограниченные участки-ампликоны

Ампликон-специфический участок ДНК ,ограниченный двумя праймерами.

С 3-го цикла начинается копирование ампликонов , до тех пор покане израсходуются компоненты реакции ,в первую очередь нуклеотиды ,полимераза и т.д.

Увеличеникампликонов происходит в геометрической прогрессии:

2 ,4 ,8,16 и т.д.

В среднем от 20 до 45 циклов ( в Real-TimePCRобычно 45)

Рост в геометрической прогрессии на последних циклах замедляется – «

эффект плато» , на что влияет утилизация праймеров ,нуклеотидов ,полимеразы ,количество ингибиторов(праймеров-димеров,конкурирующих за полимеразу) ; неполная денатурация при высокой концентрации специфичес-

ких продуктов.

Время амплификации 1,5-2,5 часа.

Для РНК-содержащих вирусов амплификации предшествует этап обратной транскрипции

(ОТ) 50⁰С ,продолжительность 30 мин.

• Детекция продуктов ПЦР

По способу детекции выделяют следующие варианты ПЦР:

ПЦР с детекцией методом электрофореза в агарозном или полиакриламид

ном геле с применением интеркалирующих красителей (этиленбромид).

Классический вариант ПЦР-анализа. Синтезированной количество ДНК

помещается вместе с красителем в электрическое поле для последующего

электрофореза ,учет в трансиллюминаторах в УФО в отдельном помещении

,трансиллюминаторыкомпьютеризированы.Детекция в течение 1 часа.

Требуется извлечение наработанных ампликонов из пробирки ,что повышает

риск контаминации других проб из положительных образцов.

Исследование качественное ,не возможно определить количество искомой

ДНК и оценить кинетику процесса.

ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в реальном времени / по конечной точке

- метод основан на количественной флуоресцентно-гибридизационнойдетекцией специфических продуктов амплификации ,в которых специальные

красители используются для наблюдения за развитием амплификации .

Используются термоциклеры (амплификаторы) ,совмещенные с детектором

флуоресценции.

В современных амплификаторах ,предназначенных для детекции продуктов ПЦР в режиме реального времени предусмотрены варианты детекциинесколь-

ких флуоресцентных красителей (флуорофоров) одновременно.

Детекция отдельного красителя происходит в определенном диапазоне-канале.

Наиболее распространенные красители (каналы):

FAM(синий) -наиболее чувствительный

HEX (зеленый)

ROX (оранжевый)

Cy5 (фиолетовый)

Cy3 (фиолетовый)

Варианты проведения ПЦР:

на 2 канала –FAMи HEX

на 3 канала –FAM, HEX и ROX

на 4 канала –FAM, HEX, ROX и Cy5

Мультиплексное ПЦР позволяет в одной пробирке искать сразу несколько

возбудителей.

При использовании 4 и более каналов возможно засвечивание мишеней.

В тест-системах для ПЦР в реальном времени используются специальные

зонды ,состоящие из флуорофора(красителя) , олигонуклеотида и гасителя-вещества ,подавляющего флуоресценцию (свечение).

Структура зонда:

Флуорофор

Олигонуклеотид

Гаситель

флуорофор и гаситель разделены между собой 5-6 нуклеотидами-контактное

тушение.

В процессе амплификации ДНК-полимераза отсекает флуорфор от гасителя

за счет экзонуклеазной активности и регистрируется флуоресцентный сигнал.

Флуорофор (краситель) поступает раствор в конце удлинения цепи (элонгации)

и встроенный детектор улавливает сигнал флуоресценции. в конце каждого цикла , всего до 45 циклов.

Сигнал флуоресценции в ходе амплификации возрастает пропорцианально

количеству продуктов амплификации , что позволяет проследить ход реакции

и судить об исходном количестве ДНК в образцах.

Результаты флуоресценции(«разгорания») зонда фиксируются детектирующим устройством и обрабатываются компьютерной программой и выводятся на

экран в виде обработанных кривых:

Флуоресценция положительных образцов усиливается с каждым циклом ампли

фикации ,а отрицательных образцов остается на базовом уровне.

По мере расходования компонентов реакции кривая переходит в плато.

В положительных образцах кривая амплификации переходит в плато до 40

цикла.

После 40 цикла – отрицательный образец.

Время амплификации от 1ч 20 мин до 2 ч 20 мин.

Достоинства ПЦР-диагностики:

• Высокая чувствительность метода

• Возможность диагностики на ранних стадиях заболевания

• Исследование различного материала от больных

(плазма/сыворотка крови;соскобы со слизистых оболочек,ликвор,мокрота

моча ,эякулят ,пунктаты)

• Выявление широкого спектра возбудителей,включаятруднокультивиру-

емые и некультивируемые бактерии,вирусы,простейшие.