Гипотеза

Гипотеза исследования предполагает, что аутоантитела, о которых говорилось ранее, в норме выполняют негативную регуляцию пролиферативной активности тканей, а сами же они находятся под регуляторным контролем со стороны иммунной системы, осуществляемый антиидиотипическими лимфоцитами. Также, согласно гипотезе, мы предполагаем наличие физиологических границ, в рамках которых иммунная сеть сбалансирована: для каждого аутоантигена(антиидиотип) есть комплементарное ему аутоантитело(идиотип).

- Если в организме избыточное количество аутоантигена (антиидиотипа) по сравнению с аутоантителами (идиотипами), то это приводит к неконтролируемому росту ткани, т.е. возникает рак.

- Если же, наоборот, антиидиотипических клеток будет в недостатке, то развиваются аутоиммунные заболевания. [56]

Эти данные дают основание предполагать, что избыток аутоантител приводит к возникновению аутоиммуных заболеваний, а недостаток – к опухоли. (Рис 3)

Рис 3. Гипотеза исследования. Пунктиром указаны физиологические границы. а — анти; Ид — идиотип

Таким образом, одним из механизмов регуляции функционирования иммунной системы (содержания антител) является механизм сетевого сбалансированного взаимодействия между идиотипами (идиотипами антител) и антиидиотипами (иммуноглобулиновыми лимфоцитарными рецепторами, активные центры которых определяют специфичность антиидиотипов).

Глава 2. Организация и методы исследования

2.1. Организация исследования

Исследование проводилось на базе лаборатории экспериментальной иммунологии кафедры иммунологии и клеточной биологии ФГБОУ ВПО «УдГУ».

Было проведено 7 экспериментов на лабораторных животных.

Для исследования были использованы крысы Wistar, самцы, возраста 10-11 недель и весом 0,120-0,250 кг. Животные находились в стандартных условиях: свободный доступ к еде, воде; 12-часовой световой день.

Работа с культурой клеток проводилась в стерильных условиях - под ламинаром.

2.2. Методы исследования

1) Подготовка лимфоцитов и плазмы крови для культивирования с клетками щитовидной железы in vitro

Забирают 3-5 мл крови с гепарином у контрольной и опытной крыс из сердца стерильно.

 Кровь разводят средой (RPMI 1640) не менее чем в два раза, разделяют на 2 части, перенеся в разные пробирки. Одну часть центрифугируют 15 минут при 3000 об/мин и собирают плазму. Другую часть крови наносят на фиколл-урографин по методу A. Boyum в соотношении 1:2 (1 мл фиколл-урографина на 2 мл разбавленной крови), центрифугируют 15 минут при 3000 об/мин.

Этот метод очень распространен и является самым оптимальным для выделения лимфоцитов из периферической крови. Он основан на разделении клеточных элементов крови при центрифугировании в градиенте плотности смеси полисахарида фиколла и рентгеноконтрастного вещества урографина, создающего градиент с такой плотностью, которая позволяет при центрифугировании разделить клетки периферической крови на 2 фракции. Одна из них - мононуклеарная фракция (МФ). В нее входят лимфоциты, субпопуляция моноцитов и бластные гемопоэтические клетки. Вторая фракция содержит гранулоциты и эритроциты. МФ обладают меньшей плотностью и располагаются над градиентом. Плотность гранулоцитов и эритроцитов больше, чем плотность градиента, поэтому они проходят через градиент, опускаясь на дно пробирки [57].

 Осторожно подводят кончик автоматической пипетки к слою лимфоидных клеток, отбирают и переносят в стерильную пробирку. Собирают лимфоциты, отмывают их три раза в среде RPMI-1640.

 Подсчитывают количество выделенных клеток (Д.К. Новиков, В.И. Новикова, 1996). Для этого осадок лимфоцитов доводят средой до объема 1 мл, берут аликвоту в 20 мкл и добавляют к 20 мкл трипанового синего. Подсчитывают количество клеток в 20 квадратах камеры Горяева (содержание клеток в 1 мкл = (Х*2*4000):320, где х - количество подсчитанных клеток). [58]

Полученные лимфоциты разделяют на 4 эппендорфа по 10^6 клеток. В 2 из них добавляют среду в соотношении 1:1. А в 2 других эппендорфа добавляют донорской и аутосыворотки в таком же соотношении. Инкубируют 1 час при 37⁰ С.

 Отмывают 3 раза 5 мин. 1500 об/мин

2) Подготовка клеток щитовидной железы (источник аутоантигена) для культивирования с лимфоцитами in vitro.

У крысы извлекают щитовидную железу в стерильных условиях (под ламинаром), переносят в стерильную чашку петри в среду(RPMI 1640).

I. Щитовидную железу очищают от соединительных тканей и промывают средой (RPMI 1640), нарезают на мелкие кусочки (механическая дезагрегация) с помощью скальпеля, полученные кусочки ткани промывают несколько раз.

II. Гомогенизация ткани с помощью трипсина. 0,25 % трипсин. Соотношение: на 2 г ткани – 20 мл трипсина. Инкубируют при 37⁰С. Через каждый час забирают надосадок и добавляют свежий раствор трипсина Надосадок центрифугируют, отмывают 5 мин. 1500 об/мин. [59,60]

Трипсин - фермент с противовоспалительным и противоотёчным действием, обладает свойствами расщепления фибринозных образований, омертвевших участков тканей.. Трипсин безопасен и неактивен в отношении здоровых тканей, из-за присутствия в них ингибиторов данного фермента. Трипсин не оказывает влияния на систему гемостаза, а действует только на омертвленные клетки.

 Подсчитывают количество выделенных клеток в камере Горяева (окрашивание трипановым синим). Для этого осадок клеток щитовидной железы доводят средой до объема 1 мл, берут аликвоту в 20 мкл и добавляют к 20 мкл трипанового синего. Подсчитывают количество клеток в 20 квадратах камеры Горяева (содержание клеток в 1 мкл = (Х*2*4000):320, где х - количество подсчитанных клеток).

• Полученные клетки обрабатывают митомицином в течение 45 мин на водяной бане при 37⁰С (10 мкл митомицина на 100 мкл суспензии клеток) [59]

Митомицин — антибиотик с противоопухолевой активностью, выделенный из культуры гриба Streptomyces caespitosus. Применяется для подавления чрезмерной пролиферативной активности ткани и используется в терапии в онкологии.

• отмывают 3 раза 5 мин. 1500 об/мин.

3) Постановка культуры клеток.

В лунки 24-луночного культурального планшета наливают по 1 мл полной питательной среды (ППС – 10 мл RPMI 1640 + 30 мкл гентамицина).

Гентамицины — антибиотики аминогликозидного ряда широкого спектра действия. Гентамицин продуцируется бактерией Micromonospora. Препарат блокирует синтез белка бактериальных клеток, тем самым препятствует их дальнейшему размножению. Гентамицин нарушает передачу генетической информации патогенными микроорганизмами и обладает бактериостатическим воздействием.

Планшеты произведены компанией Costar, США. В каждую отдельную лунку со средой добавляют подготовленные лимфоциты. Далее добавляют клетки щитовидной железы, обработанные митомицином в равном количестве клеток на каждую лунку. Инкубируют 5 дней, 37⁰С, 5 % СО2.

 В итоге получается 6 лунок:

1 лунка: Полная питательная среда 1 мл;

2 лунка: Полная питательная среда 1 мл + Лимфоциты (10^6 клеток)

3 лунка: Полная питательная среда 1 мл + клетки Щитовидной железы (10^5 - 10^6 клеток)

4 лунка: Полная питательная среда 1 мл + Лимфоциты(10^6 клеток) + клетки щитовидной железы(10^5 - 10^6 клеток);

5 лунка: Полная питательная среда 1 мл + Лимфоциты(10^6 клеток) с аутоплазмой + клетки щитовидной железы(10^5 - 10^6 клеток);

6 лунка: Полная питательная среда 1 мл + Лимфоциты(10^6 клеток) с плазмой донора + клетки щитовидной железы (ЩЖ) (10^5 - 10^6 клеток);

Через 5 дней инкубации [67-69] определяют количество глюкозы в среде глюкозооксидазным методом. По количеству потребленной глюкозы говорят об активации лимфоцитов в культуре.

4) Глюкозооксидазный метод (количественное определение содержания глюкозы в крови, используя набор “ГЛЮКОЗА-ФКД”):

Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в крови и моче основан на реакции окисления глюкозы кислородом воздуха в присутствии фермента глюкозооксидазы с образованием перекиси водорода. Перекись водорода в присутствии пероксидазы окисляет ортотолидин с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию глюкозы. О концентрации глюкозы судят по количеству окрашенных продуктов.

1. Приготовление рабочего раствора: таблетку “ферменты-хромогены” растворить в 100мл дистиллированной воды, тщательно перемешивая, не встряхивая. Допускается наличие мелких нерастворимых частиц;

2. Определение содержания глюкозы в сыворотке крови. При использовании КФК внести в пробирки образцы сыворотки крови и реагенты по схеме:

Для кювет	С длиной оптического пути 5 мм
Реагенты	Опытная проба, мл	Калибр. Проба, мл	Холостая проба, мл
Рабочий раствор	2.0	2.0	2.0
Сыворотка крови	0.02	_ _ _	_ _ _
Калибратор	_ _ _	0.02	_ _ _
Вода дист.	_ _ _	_ _ _	0.02

3. Пробы тщательно перемешать и инкубировать в течение 15 мин при температуре +37°С (водный термостат);

4. После окончания инкубации измерить величину оптической плотности опытной и калибровочной проб против холостой пробы в кюветах с длиной оптического пути 5мм при длине волны 490 нм;

5. Расчет концентрации глюкозы в пробах провести по формуле:

С = (Е0/ Ек) * 10,

где: С – концентрация глюкозы, ммоль/л;

Е0 – оптическая плотность опытной пробы, ед. опт. плотн.

Ек – оптическая плотность калибровочной пробы, ед. опт. плотн.

10 – концентрация глюкозы в калибраторе, ммоль/л.

6. Посчитать потребление глюкозы лимфоцитами и клетками щитовидной железы по изменению концентрации глюкозы относительно полной питательной среды.

7. Провести сравнительный анализ результатов эксперимента. Сделать соответствующие выводы.

Дизайн

Рис 4. Дизайн эксперимента. Схема. Лунки планшета, заполненные культурой клеток для последующей их инкубации (5 дней, 37⁰ С, 5 % СО₂)

ППС – полная питательная среда, Л – лимфоциты, ЩЖ – клетки щитовидной железы, Ауто – аутоплазма, Дон – плазма донора.