Развернутые реакции агглютинации.

Развернутые реакции агглютинации предложены для поиска антител в сыворотках крови инфицированных пациентов при некоторых бактериальных инфекциях. При этом применяются диагностикумы, приготовленные из микроорганизмов.

Для выполнения этих реакций необходимо предварительное титрование сыворотки.

Чтобы приготовить первоначальное разведение сыворотки 1:10, необходимо взять пипеткой 1 мл цельной сыворотки больного и добавить 9 мл физиологического раствора, таким образом:

Разведение 1:10 это 1мл сыворотки + 9 мл физ. раствора

1:50 это 1 мл сыворотки + 49 мл физ. раствора или

1:50 это 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физ. раствора

1:100 это 1 мл сыворотки + 99 мл физ. раствора или

1:100 это 0,1 мл сыворотки +9,9 мл физ. раствора.

Для выполнения развернутой РА необходимо приготовить ряд пробирок, в которых вначале готовятся разведения сыворотки. Например, чтобы приготовить двукратные разведения сыворотки, выполняем следующее:

В 10 пробирок вносим по 2,5 мл физиологического раствора. 8 пробирок будут опытными, 2 – контрольными: контроль сыворотки и контроль антигена. Затем в первую пробирку добавляем 2,5 мл сыворотки больного, разведенную 1:50. Это значит, что в первой пробирке получилось 5 мл разведенной 1:100 сыворотки. Перемешиваем пипеткой, затем набираем 2,5 мл жидкости и переносим ее во вторую пробирку. После перемешивания объем жидкости становится 5 мл с титром 1:200, переносим 2,5 мл в третью пробирку и, таким образом, разведение сыворотки в ней получится 1:400. Повторяем эти манипуляции с разведением во всех 8 опытных пробирках. Из 8 пробирки 2,5 мл жидкости сливаем пипеткой в дезинфицирующий раствор.

В контроль сыворотки вносим только разведенную сыворотку в объеме 2,5 мл, в контроль антигена - только взвесь диагностикума.

Затем во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносим по 1 мл взвеси диагностикума. В результате образования агглютината мутная жидкость в пробирках просветляется, на дно оседает осадок агглютината. Учет реакции начинается с контрольных проб: в контроле сыворотки должна быть прозрачная сыворотка, в контроле антигена- равномерно мутная взвесь диагностикума. Титр РРА учитывается по разведению сыворотки, в которой еще явственно видно формирование осадка агглютината. Схема разведения сыворотки и постановки РРА представлена на рис. 7.

Рис.7. Схема разведения сыворотки и постановки развернутой реакции агглютинации.

Таблица 3.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РАЗВЁРНУТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ С СЫВОРОТКОЙ БОЛЬНОГО ПО ВИДАЛЮ (РАЙТУ)

Ингредиенты	Содержимое пробирок				Контроль
					Сыворотки	Антигена
Физиологический раствор 0,85 % хлорида натрия, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	-	0,5
Сыворотка в разведении 1:50 мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5 (1: 50)	--
Разведения	1: 100	1: 200	1: 400	1: 800	-
Диагностикум, 1-2 млрд. микробных тел в 1 мл.	2к	2к	2к	2к	-	2к
	В термостат при +37С° на 2 часа, затем на 18-20 часов при комнатной температуре

Учёт результатов реакции агглютинации по интенсивности образования агглютината (обозначается крестами).

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ПЕРЕКРЁСТНОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ПО КАСТЕЛЛАНИ

Принцип метода:

Перекрёстная РА направлена на извлечение групповых антител методом адсорбции и основана на правиле - специфический антиген (АГ) изымает из сыворотки все антитела — и специфические только для него, и групповые; неспецифический АГ — только групповые.

В данной реакции наряду со специфическим антигеном используют родственные гетерологические АГ. Например, у больного брюшным тифом (Т) сыворотка крови дала агглютинацию со специфическим диагностикумом Т и с групповым паратифа А.

Диагностикум с антигенами паратифа А (ABEF)

1 этап

2 этап

Оценка РА: в данном примере: больной страдает брюшным тифом.

Рис. 8. Схема постановки реакции Кастеллани.

Метод Нобля основан на использовании концентрированных ингредиентов (микробной взвеси, сыворотки больного) и применении механического фактора, ускоряющего агглютинацию (энергичное встряхивание пробирок), что позволяют получить результаты через 2-5 минут.

Таблица 4.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ НОБЛЯ

Ингредиенты	Номер опыта					Контроль
	1	2	3	4	5	Сыворотки	Антигена
Физ. раствор, мл	0,8	0,8	0,8	0,8	0,8	0,9	0,9
Сыворотка больного в разведении 1:5, мл	0 ,1	0 ,1	0 ,1	0 ,1	0 ,1 дез. р-р	0,1	-
Разведение сыворотки	1: 10	1: 20	1: 40	1: 80	1: 160
Диагностикум (взвесь известных микробов 3-6 млрд. мт/мл)	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	-	0,1
Встряхивать 3-5 минут, дать постоять

При оценке результатов реакции используют поправочный коэффициент 10, который отражает разницу между адсорбционными процессами в концентрированных растворах антител и в растворах обычной концентрации. Таким образом, разведение 1:20 по Ноблю соответствует 1:200 при обычной постановке развёрнутой РА.

Таблица 5.