1. Выделение днк (рнк) из исследуемого материала (пробоподготовка).
Клетки лизируют детергентами или высокой температурой. Затем отделяют ДНК от клеточных обломков и разрушают клеточные нуклеазы. Все это обеспечивают приборы: миницентрифуги, развивающие скорость 12000 -14000 оборотов в минуту, вортексы для перемешивания, минитермостаты для пробирок, обеспечивающие быстрое изменение температуры от +30°С до +100°С.
2. Непосредственная амплификация выделенных участков (копий) нуклеиновых кислот.
ПЦР обеспечивает быстрое и многократное умножение, амплификацию (amplification — усиление, увеличение) количества фрагментов генома. Для этого в пробирку с выделенной ДНК добавляют необходимые реактивы и помещают в амплификатор (термоциклер). Этот прибор позволяет циклически изменять и поддерживать перепады температур в пробирке на несколько десятков градусов за несколько секунд. Если в пробирке есть искомая ДНК, то в ней происходит ряд процессов:
В результате нагревания до 94 -95°С двойная цепь ДНК разделяется на две отдельные цепи.
К одноцепочечной ДНК-мишени присоединяется праймер.
Праймер — это последовательность из 15 — 30 нук-леотидов, комплементарная маркерному фрагменту ДНК. При создании оптимальной температуры (45-70°С) происходит связывание (отжиг) праймера с соответствующим участком ДНК: один праймер — на одной нити, другой — на второй нити ДНК. Отжиг протекает в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина — цитозин.
- Синтез (элонгация) — достраивание второй цепи
ДНК.
ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды к праймерам, достраивая двухцепочечные фрагменты ДНК (~ при 72°С). Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых цепей в следующем цикле амплификации — это и есть цепная реакция в ПЦР. В результате количество копий фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии и через 25 циклов амплификации синтезируется 106 копий фрагмента. Через 30 — 40 циклов синтезируется такое количество ДНК, которое можно визуально учитывать после электрофореза в агарозном геле или другими способами.
3. Определение (детекция) продуктов пцр, полученных на втором этапе.
В
ыявление
наработанного продукта чаще всего
проводят при помощи электрофореза в
2-3% агарозном геле, содержащем бромид
этидия (специфический флюоресцентный
краситель ДНК). Поглощая ультрафиолетовый
свет краситель, связанный с ДНК,
флюоресцирует. В результате видна
оранжевая полоска на уровне контрольной
ДНК. Кроме того, используют
ферментно-гибридизационный метод или
ПЦР в режиме «реального времени» с
помощью флюоресцентных красителей.
Тестовый контроль:
1. Что такое трансформация?
а) восстановление поврежденной ДНК;
б) передача генетической информации при контакте бактериальных клеток
разной «половой» направленности;
в) передача генетической информации с помощью фрагмента ДНК;
г) передача генетической информации от клетки донора клетке реципиента с
помощью бактериофага.
2.Для конъюгации характерно:
а) передача генетического материала при помощи бактериофага;
б) необходим контакт клеток донора и реципиента;
в) передача генетического материала с помощью РНК;
г) передача генетического материала с помощью полового фактора.
3.Для трансдукции характерно:
а) передача генетического материала при помощи бактериофага;
б) необходим контакт клеток донора и реципиента;
в) передача генетического материала с помощью РНК;
г) передача генетического материала с помощью полового фактора.
4. У каких микроорганизмов материальной основой наследственности является РНК?
а) у бактерий;
б) у спирохет;
в) у РНК-содержащих вирусов;
г) у ДНК-содержащих вирусов;
д) у микоплазм.
5. Что относят к внехромосомным генетическим структурам?
а) рибосомы;
б) полисомы;
в) плазмиды;
г) мезосомы;
д) ранспозоны.