10. Методы диагностики вирусных инфекций.

 

Лабораторная диагностика вирусных инфекций базируется на 3 группах методов:

Вирусологический метод  - выделение вируса из ис­следуемого материала и его идентификация.

Серологический метод - определение в сыворотке крови больных специфических противовирусных антител с помощью разнообразных иммунологических реакций.  

Генодиагностика - обнаружение в материале от больного специфичных  для данного вируса фрагментов нуклеиновых кислот вирусов-воз­будителей с помощью метода зондов (гибридизация НК) или ПЦР.

Прямое вирусоскопическое исследование мазков из клинического материала, окрашенных анилиновыми красителями,   с целью выявления вирусов в настоящее время в практике работы вирусологических лабораторий проводится редко. Чаще применяются с целью поиска антигенов вируса ИФМ или микроскопический вариант ИФА как экспресс-методы диагностики вирусных инфекций. 

Взятие и подготовка материала для вирусологической диагностики

Вирусологическому исследованию подвергают содержимое везикул, пустул, соскобы эпителия, спинномозговую жидкость, фекалии, мазки и смывы из верхних дыхательных путей, взятые у больного с соблюдением правил асептики в ранние стадии вирусной инфекции. Мазки из носоглотки и  кожные соскобы помещают в ИРХН или раствор Хенкса с 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками (для подавления сопутствующей микрофлоры).  Исследуемый материал хранят и пересылают в вирусологическую лабораторию в специальных контейнерах с сухим льдом. Пробы можно сохранять в условиях глубокой заморозки (-70⁰ С).

Вирусологический метод

Поскольку вирусы относятся к облигатным внутриклеточным паразитам и на искусственных питательных средах не растут, для их культивирования  применяются живые системы (культуры клеток, развивающиеся куриные эмбрионы, чувствительные лабораторные животные).

Выделение вирусов на культурах клеток

В практике вирусологических лабораторий для выделения вирусов используют первично-трипсинированные, полуперевиваемые (дип­лоидные) и перевиваемые клеточные культуры.

Первично-трипсинированные культуры клеток можно получить из любых  органов и тканей человека, животных, насекомых, растений, однако наиболее часто используются эмбриональные ткани (фибробласты куриного эмбриона, человека, и др.), обладающие повышенной способностью к росту и размножению.

Для получения клеточной взвеси ткань отмывают от крови в растворе Хенкса, измельчают ножницами и несколько раз обрабатывают трипсином на магнитной мешалке или путем пипетирования. Затем взвесь клеток отмывают от трипсина раствором Хенкса путем центрифугирования при 600 об/мин в течение 5—10 мин, ресуспендируют в питательной среде и определяют  концен­трацию клеток в камере Горяева. Клеточную взвесь разводят питательной средой (обычно среда № 199 с добавлением сыворотки крупного рогатого скота) до концентрации 4-8х10⁵ клеток в 1 мл, разливают в культуральные сосуды,  закрывают резиновыми пробками. Пробирки укладывают под углом 5⁰.  Культивирование клеток осуществляют в термостате при 35-37⁰ С  48-96 часов, в течение которых формируется монослой клеток, прикрепляющийся к поверхности стекла (или пластика).

С помощью версена (натриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты - ЭДТА) (реже трипсина), клетки  можно снять с поверхности культуральной емкости и перенести их в другую емкость (произвести пассаж). Для этого в сосуды с клетками после отсасывания питательной среды наливают 0,02% ра­створ версена  или 0,25% трипсина и помещают их на 3-5 мин в термостат. Затем версен или трипсин удаляют, в культуральный сосуд добавляют небольшое количество питательной среды, в которой суспендируют клетки, подсчитывают их количество, доводят их до  требуемой концентрации и разли­вают в новые флаконы. Однако первично-трипсинизированные  клеточные культуры  не выдерживают более 5-10 пассажей. 

Перевиваемые клеточные культуры, в отличие от первично-трипсинированных, переносят неограниченное число пассажей, так как обычно их получают из опухолевых клеток, имеющих высокие способности к росту. Широкое распространение в вирусологии получили культуры клеток карциномы шейки матки (HeLa), раковой опухоли гортани (НЕр-2), костного мозга больного раком легких (Detroit-б) и т.д. Созданы «банки» перевиваемых клеточных культур, в которых хранятся клетки, замороженные жид­ким азотом.

Полуперевиваемые (диплоидные) культуры  получают путем  нескольких пассажей, в результате чего формируется  популяция клеток, способных выдержать до 60 пассажей, быстро размножаться, быть высокочувствительными ко многим вирусам,  сохраняя при этом исходный набор хромосом.

Для культивирования клеток используются специальные стерильные питательные среды (например, среды 199, Игла, гидролизат лактальбумина и др.) с рН 7,2-7,6, содержащие полный набор аминокислот,  витамины, факторы роста и набор минеральных веществ, к которым добавляют от 2 до 30 % сыворотки крови животных (сыворотка крупного рогатого скота, эмбриональная телячья сыворотка и др.), а также антибиотики для предотвращения роста бактериальной флоры. Среды содержат индикатор феноловый красный, который имеет оранжево-желтый цвет при кислой реакции среды и красно-малиновый цвет в щелочной среде. Поддерживающие среды либо не содержат сыворотки, либо содержат ее в небольшом количестве.  Их применяют для сохранения вырос­ших клеток после заражения их вирусами.

Для выделения вирусов питательную среду из пробирок с культурой клеток удаляют, про­мывают монослой клеток раствором Хенкса для удаления сывороточных антител и ингибиторов, после чего в пробирку вносят 0,1-0,2 мл обработанного вируссодержащего материала. Через 30-60 мин после заражения материал из пробирки удаляют, вносят 1 мл поддер­живающей среды и пробирки помещают в термостат при 37⁰ С для культивирования.

Выделение вирусов на развивающихся куриных эмбрионах

Для культивирования вирусов используют  6-15-дневные ку­риные эмбрионы. Заражение осуществляют  на хорион-аллантоисную оболочку (ХАО), в желточный мешок, полость амниона и аллантоиса.

При заражении на ХАО скорлупу обрабатывают спиртом, йодом и снова спир­том. Скорлупу  прокалывают над воздушным мешком, а сбоку в скорлупе делают отверстие размером 7x2 мм. Не повреждая оболочку под скорлупой, короткой тонкой иглой шприца наносят на ХАО 0,1—0,2 мл вирусосодержащего материала. Заражение в полость аллантоиса осуществляют путем введенияисследуе­мого материала шприцем на глу­бину 10—15 мм через боковое отверстие в скорлупе.

В полость амниона вирусосодержащий матери­ал  вводят через отверстие на тупом конце яйца, при этом  игла шприца должна быть направлена к телу эмбриона.

Дефекты скорлупы заливают стерильным парафином и эмбрионы помещают в термостат.

Выделение вирусов на экспериментальных животных.

 Экспериментальные животные в вирусологии применяются для диагностики вирусных инфекций, получения иммунных противовирусных сывороток и компонентов крови (эритроцитов, лейкоцитов, плазмы и т.д.), моделирования вирусных инфекций с научными целями для изучения патогенеза, иммунитета, патоморфологии и т.д., а также для разработки способов специфической и неспецифической про­филактики и лечения вирусных инфекций.

В вирусологии в качестве экспериментальных животных наиболее часто  используются белые мыши, морские свинки, кролики, хомячки, хлопковые крысы, обезьяны. Чувствительной моделью при ряде вирусных инфекций являются новорожденные грызуны.   

Правила заражения и вскрытия экспериментальных животных при ви­русных и бактериальных инфекциях идентичны.

Экспресс-диагностика вирусных инфекций

Экспресс-диагностика вирусных инфек­ций применяется для выявления вирусов или их антигенов в различных видах клинического ма­териал с помощью методов, характеризующихся высокой  специфич­ностью, чувствительностью, информативностью и быстротой исполнения.  

Реакция иммунофлюоресценции  (прямой и непрямой методы РИФ) применяется для выявления вируса в материале, полученном от больных, в инфицированных культу­рах клеток и в организме чувствительных животных.

Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ) отличается возможностью одновременной концентрации вируса и его идентификации с помощью специфической противовирусной сыворотки.  Для этого вируссодержащий материал обрабатывают противовирусной сывороткой, затем добавляют фосфорно-вольфрамовую кисло­ту или уранилацетат, смесь наносят на пленку (под­ложку) и высушивают. При электронной микроскопии при положительном результате находят скопления вирусных частиц. ИЭМ применяют для выявления в исследуемом мате­риале полиовирусов, цитомегаловирусов, вирусов гепатита А и В, некультивируемых вирусов (аденовирусов в ткани миндалин, энтеро- и ротавирусов в фекалиях, вирусов оспы в ос­пенном детрите).

Встречный иммуноэлектрофорез обычно применяется для обнаружения в сыворотках крови больных вирусных антигенов (например, HBsAg у больных гепатитом В). Реакцию ставят на стеклянных пластинах в слое агаре, в котором  вырезают два параллельных ряда лунок. Сыворотки крови, содержащие антигены по­мещают в лунки, расположенные ближе к катоду, а соответствующие противовирусные сыворотки (антитела) - в лунки, находящиеся ближе к аноду, после чего проводят электрофорез, при котором HBsAg, с отрицательным зарядом передвигается к аноду, а ан­титела — к катоду. Учет реакции осуществляется через 12-24 часа, положительные результаты реакции характеризуются образованием линий преципитации между определяемым антигеном (HBsAg) и специфическим антителом.

Реакция гемадсорбции на твердой основе (РгадТО). Лунки полистироловых планшетов обрабатывают иммуноглобулином  или иммунной сывороткой (например, против ротавирусов), вносят в них исследуемый вируссодержащий  материал, через 30-60 мин лунки промывают буферным раствором, после чего добавляют взвесь сенсибилизированных специфическим иммуноглобулином эритроцитов и спустя 30-60 мин производят учет по наличию гемагглютинации. Если в исследуемом материале содержится специфический вирусный антиген, он соединя­ется с антителами иммуноглобулина (или сыворотки), адсорбированными на поверхности лунок, а затем с иммуноглобулинами на поверхности эритроцитов, в ре­зультате чего происходит гемагглютинация. В опи­санной модификации реакция применяется для выявления антигенов ротавирусов и других вирусов в фекалиях больных.

 

11.       Особенности противовирусного иммунитета. Интерфероны. Возрастные особенности противовирусного иммунитета. Значение плацентарного иммунитета в защите новорожденного от некоторых вирусных инфекций (корь и др.)

 

Интерфероны — гликопротеины, вырабатываемые клетками в ответ на вирусную инфекцию и другие стимулы. Бло­кируют репродукцию вируса в других клетках и участвуют во взаимодействии клеток иммунной системы. Различают две се­рологические группы интерферонов: I тип — ИФН-α и ИФН -β; II тип — ИФН-.γ Интерфероны I типа оказывают противовирус­ные и противоопухолевые эффекты, в то время как интерферон II типа регулирует специфический иммунный ответ и неспеци­фическую резистентность.

α- интерферон (лейкоцитарный) продуцируется лейкоцитами, обработанными вирусами и другими агентами. β-интерферон (фибробластный) продуцируется фибробластами, обработанными вирусами.

ИФН I типа, связываясь со здоровыми клетками, защищает их от вирусов. Антивирусное действие ИФН I типа может обуславливаться и тем, что он способен угне­тать клеточную пролиферацию, препятствуя синтезу аминокис­лот.

ИФН-γ продуцируется Т-лимфоцитами и NK. Стимулирует активность Т- и В-лимфоцитов, моноци­тов/макрофагов и нейтрофилов. Индуцирует апоптоз активированных макрофагов, кератиноцитов, гепатоцитов, клеток костного мозга, эндотелиоцитов и подавляет апоптоз периферических моноцитов и герпес-инфицированных нейронов.

Генно-инженерный лейкоцитарный интерферон получают в прокариотических системах (кишечной палочке). Биотехнология получения лейкоцитарного интерферона включает следующие этапы: 1) об­работка лейкоцитарной массы индукторами интерферона; 2) выделение из обработанных клеток смеси иРНК; 3) получение суммарных комплемен­тарных ДНК с помощью обратной транскриптазы; 4) встраивание кДНК в плазмиду кишечной палочки и ее клонирование; 5) отбор клонов, содержащих гены интерферона; 6) включение в плазмиду сильного промо­тора для успешной транскрипции гена; 7) экспрессия гена интерферона, т.е. синтез соответствующего белка; 8) разрушение прокариотических клеток и очистка интерферона с помощью аффинной хроматографии.

Интерфероны применяются для профи­лактики и лечения ряда вирусных инфекций. Их эффект определяется до­зой препарата, однако высокие дозы интерферона оказывают токсическое действие. Интерфероны широко применяются при гриппе и других острых респираторных заболеваниях. Препарат эффективен на ранних стадиях за­болевания, применяется местно. Интерфероны оказывают терапевтическое действие при гепатите В, герпесе, а также при злокачественных ново­образованиях.