29. Цикл трикарбоновых кислот. Последовательность реакций. Ферменты. Синтез аминокислот, сопряженный с цтк.

В аэробных условиях пируват, образовавшийся в результате гликолиза, диффундирует из цитоплазмы в матрикс митохондрий, где функционирует большинство ферментов цикла Кребса, и полностью окисляется до CO2 с образованием большого количества АТФ. Непосредственно в цикле Кребса окисляется не сам пируват, а его производное — ацетил-СоА. Поэтому процесс окисления пирувата делится на два этапа:

• окислительное декарбоксилирование пирувата до ацетил-СоА;

• окисление ацетил-СоА в цикле Кребса.

Первый этап катализируется пируватдегидрогеназным комплексом, который включает три фермента: пируватдегидрогеназу, дигидролипоилтрансацетилазу и дигидролипоилдегидрогеназу .

Процесс окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты идет в пять стадий:

1. Пируват взаимодействует с тиаминпирофосфатом (ТПФ) пируватдегидрогеназы и декарбоксилируется.

2.Пируватдегидрогеназа передает два электрона и ацетильную группу от ТПФ на окисленную форму липоиллизина, являющегося основой фермента. В результа- те формируется ацетил-тиоэфир восстановленной формы липоиллизина.

3. Затем происходит расщепление тиоэфирной связи липоиллизина и взаимодейст- вие ацетата с серосодержащим коэнзимом А (СоА). В итоге образуются полно- стью восстановленная форма липоиллизина и ацетил-СоА.

4. Дигидролипоилдегидрогеназа окисляет дигидролипоил с образованием ФАДН2.

5. При окислении ФАДН2 ферментом E3 образуется НАДН.

Таким образом, при окислении пирувата образуются CO2 , НАДН и ацетил-СоА.

Реакции цикла Кребса:

№	Исходные в-ва	Продукты	Фермент
1	Щук, ацетилСоА, Н2О	Цитрат, НS-CoA	Цитратсинтза, 4 кл
2	Цитрат	Цис-аконитат, Н2О	Цисаконитатгидратаза, 4 кл
	Цис-аконитат, Н2О	Изоцитрат
3	Изоцитрат, НАД+	2-оксоглутарат, НАДН+Н+, СО2	Изоцитратдегидрогеназа, 1 кл
4	2-оксоглутарат, НАД+, НS-CoA	Сукцинил-СоА, НАДН+Н+,СО2	2-оксоглутаратный комплекс
5	Сукцинил-СоА, ГДФ+Фн, Н2О	Сукцинат, ГТФ, НS-CoA	Сукцинил-СоА-синтетаза, 6 кл
6	Сукцинат, ФАД	Фумарат, ФАДН+Н+	Сукцинатдегидрогеназа, 1 кл
7	Фумарат, Н2О	Малат	Фумаратгидротаза, 4 кл
8	Малат, НАД+	Щук, НАДН+Н+	Малатдегидрогеназа, 1 кл

З а один оборот цикла, состоящего из восьми ферментативных реакций, происходит полное окисление («сгорание») одной молекулы ацетил-КоА. Для непрерывной работы цикла необходимо постоянное поступление в систему ацетил-КоА, а коферменты (НАД+ и ФАД), перешедшие в восстановленное состояние, должны снова и снова окисляться. Это окисление осуществляется в системе переносчиков электронов в дыхательной цепи (в цепи дыхательных ферментов), локализованной в мембране митохондрий. 

Функции и энергетический выход Цикла Кребса:

1. Катаболическая (энергетическая). – вместе с ЭТЦ является основным поставщиком химической энергии в виде АТР. Энергетический баланс:

2. Анаболическая (метаболическая или пластическая) – субстраты цикла используются для синтеза других веществ.

3. Интегративная – объединяет пути катаболизма углеводов, жиров и белков, во всех аЭробных организмов он выступает в качестве центрального метаболического пути углерода.

30. Дыхательная электрон-транспортная цепь. Локализация переносчиков и их характеристика. Транспорт протонов и электронов. Механизм окислительного фосфорилирования. Разобщение транспорта электронов и фосфорилирования. Свободное окисление.

Кислород непосредственно участвует только в третьем этапе дыхания – в окислительном фосфорилировании, которое осуществляется с помощью дыхательной ЭТЦ. ЭТЦ локализована на внутренней мембране митохондрий и служит для переноса электронов от восстановленных субстратов на О2. Процесс переноса электронов сопровождается созданием на внутренней мембране митохондрий электрохимического градиента протонов, энергия которого трансформируется в энергию макроэргической связи АТФ.

Переносчики электрона сгруппированы в митохондриальной мембране в четыре мембранных комплекса.

Комплекс I, или НАДН-дегидрогеназа (НАДН: убихинон оксиредуктаза), состоит из гидрофобного компонента, встроенного в мембрану, и гидрофильной части. Комлекс имеет форму, похожую на башмак, который своей «подошвой» встроен в мембрану. Масса 600-900 кДа, включает в себя до 40 белковых субъединиц. В качестве редокс-центра функционирует ФМН и несколько белков, содержащих железосерные кластеры. В гидрофобной части комплекса имеется сайт для связывания убихинона.

Комплекс II, или сукцинат-дегидрогеназа (сукцинат-коэнзим Q редуктаза), состоит из четырех крупных полипептидов – двух гидрофильных, проявляющих сукцинат-дегидрогеназную активность (A и В), и двух трансмембранных гидрофобных (C, D). Редокс-центры: ФАД и три железосерных кластера. В этом комплексе имеется также цитохром b_560.

Комплекс III, или убихинол-цитохром с оксиредуктаза (цитохром b₆/c₁ комплекс). Состоит из цитохрома b, цитохрома с (цитохром с₅₅₁), железосерного белка Риске (Fe₂S₂). Цитохром b содержит два гема (565 и 560) – низкопотенциальный и высокопотенциальный. Комплекс III функционирует как димер. Имеются два участка для связывания восстановленной и окисленной форм убихинона.

Комплекс IV, или цитохром с оксидаза, включает до 13 субъединиц. Имеется четыре редокс-центра: два гемма а (а и а₃) и два Cu-центра (Cu_A и Сu_B).

Четыре комплекса ЭТЦ не связаны между собой в некий суперкомплекс, а активно диффундируют в липидном слое внутренней мембраны митохондрий. Единственный белок, не интегрированный в мембрану – цитохром c. Этот белок переносит электроны в межмембранном пространстве от комплекса III к комплексу IV.

ЭТЦ растений в отличие от животных, включает:

-альтернативную цианид-устойчивую терминальную оксидазу во внутренней мембране;

-альтернативные ротенон-устойчивые НАДН- и НАДФН-дегидрогеназы во внутренней мембране со стороны матрикса;

-НАДН- и НАДФН-дегидрогеназы на стороне внутренней мембраны, обращенной в межмембранное пространство, которые способны принимать электроны о НАД(Ф)Н, образующихся в цитозоле.

Транспорт электронов идет от одного комплекса к другому. Перенос электронов от НАДН на кислород идет по градиенту ОВ-потениала – от соединений с более отрицательным потенциалом, к акцепторам с более положительным.

В комплексе I: электроны от НАДН поступают на ФАД, далее на Fe-S-центры и затем на убихинон. Приминая два протона и два электрона убихинон (Q) восстанавливается до убихинола (QH₂). Комплекс I работает как протонная помпа: на каждый окисленный НАДН и восстановленный QH­₂ из матрикса в межмембранное пространство перекачивается протоны в соотношении 4H⁺/2e^-.

После окисления сукцината в комплексе II электроны передаются на ФАД, затем на Fe-S кластеры и далее на восстановление убихинона с использованием 2H⁺ из матрикса. Этот комплекс не перекачивает протоны, но обеспечивает вход в дых.цепь дополнительных электронов за счет окисления сукцината.

Отличительной особенностью комплекса III является то, что с переносом электронов через внутреннюю мембрану митохондрий с помощью хинонов транспортируются протоны. Механизм транспорта электронов и протонов в комплексе цитохромов b6/c1 получил название Q-цикл.

Первая часть Q-цикла (окисление первой молекулы)

1. QH₂ связывается в Q_оut-центре, окисляется до семихинона (Q•) железосерным центром белка Риске, который восстанавливается.

2. От белка Риске электрон передается на цитохром с₁, а затем на цитохром с.

3. Протоны переносятся в межмембранное пространство.

4. Семихинон нестабилен, отдает электрон на низкопотенциальный, а затем на высокопотенциальный гем.

5. Электрон пересекает мембрану, восстанавливает связанный в Q_in-центре убихинон до семихинона, который в этом центра находится в более стабильном состоянии.

Вторая часть Q-цикла (окисление второй молекулы)

1. Один из двух электронов, образующихся при окислении QH₂, через железосерные кластеры белка Риске идет на цитохром с₁, а затем на цитохром с.

2. Второй электрон через гемы (высоко- и низкопотениальные) поступает в Q_in-центр, восстанавливает семихинон до убихинола (QH₂), захватывая 2Н+ из матрикса

3. Убихинол покидает Q_in-центр и снова может окисляться в Q_out-центре.

На каждые 2 электрона, передаваемые комплексом цитохромов b6/c1 на цитохром с, через внутреннюю мембрану митохондрий переносится 4 протона.

От комплекса III через цитохром с электроны поступают в комплекс IV и далее на кислород.

Комплекс IV осуществляет последовательное окисление 4-х молекул цитохрома с, передачу 4-х электронов на молекулярный кислород и восстановление его до 2-х молекул воды:

4Fe²⁺-цит с + 8H⁺_in + O₂  4Fe³⁺-цит с + 2H₂O + 4H⁺_out

Идею о том, что процесс дыхания сопряжен с фосфорилированием АДФ и образованием АТФ высказал В. А. Энгельгардт - ему удалось показать, что при аэробном дыхании накапливается АТФ. Процесс фосфорилирования АДФ с образованием АТФ, сопряженный с переносом электронов по ЭТЦ митохондрий называется окислительным фосфорилированием.

Было предложено несколько гипотез механизма протекания этого процесса.

Согласно химической гипотезе в митохондриях за счет энергии окисления на первом этапе с помощью некого вещества Х образуется фосфорилированный интермедиат Х~Р, от которого происходит перенос фосфатной группы на АДФ. Однако вещество Х не было найдено.

Механохимический механизм предполагал, что при окислении субстратов происходят конформационные изменения митохондрий, которые и обеспечивают энергию для ситеза АТФ. Но эта гипотеза не давала ответа на вопрос: почему при работе ЭТЦ происходит подкисление среды. Ответ был получен при формулировании хемиосмотической теории Митчелла.

Согласно хемиосмотической гипотезе предложенной Митчеллом, движение электронов по электрон-транспортной цепи сопровождается транспортом ионов H из матрикса в межмембранное пространство митохондрий. В результате на внутренней мембране митохондрий формируется электрохимический градиент протонов, который и является непосредственным источником энергии для синтеза АТФ. Синтез АТФ осуществляется в процессе транспорта ионов H по градиенту концентрации через протонный канал фермента АТФ-синтазы.

Энергия окисления дыхательных субстратов в процессе переноса электронов и протонов по электрон-транспортной цепи митохондрий вначале трансформируется в энергию электрохимического потенциала ионов H (H-, или протондвижущую силу) на внутренней мембране митохондрий и только затем преобразуется в энергию макроэргической связи АТФ.

При этом возникает другой вопрос: каков же механизм трансформации энергии мембранного градиента рН в макроэргическую энергию фосфатной связи АТФ? Было предложено несколько принципов синтеза АТФ, из которых наибольший интерес представляют два — прямой механизм Митчелла и обменно-связывающий механизм Бойера.

Согласно Митчеллу синтез АТФ идет следующим образом. Вначале АДФ и Фн связываются с комплексом F1 фермента АТФ-синтазы. Далее протоны, перемещаясь по протонному каналу, взаимодействуют с одним из атомов кислорода фосфорной кислоты, который выводится из комплекса в виде воды. После этого АДФ через атом кислорода соединяется с фосфатом, образуя АТФ. На заключительном этапе происходит отделение синтезированной молекулы АТФ от ферментативного комплекса.

Механизм "связывание—обмен" Бойера предполагает, что на первом этапе происходит присоединение АДФ и Фн к активному центру фермента и синтез АТФ без притока энергии. На втором этапе ионы H , перемещаясь по протонному каналу АТФ-синтазного комплекса, вызывают конформационные изменения в каталитическом центре, в результате чего происходит высвобождение АТФ.

Процесс образования макроэргических связей очень чувствителен к действию различных неблагоприятных факторов и прекращается гораздо раньше, чем наступает нарушение дыхания. Сохраняющееся на прежнем уровне или даже усиленное дыхание при этом становится неполноценным, оно утрачивает свою физиологическую эффективность и уже не выполняет физиологической функции поставщика энергии. Освобождающаяся, в этом случае энергия превращается в тепло или в свет и рассеивается в пространстве. Явление, когда дыхание идет интенсивно, а фосфорилирование отсутствует, носит название разобщения. Отсюда же возникает понятие о двух типах дыхания: оно считается продуктивным, когда одновременно с окислением происходит фосфорилирование, и непродуктивным, когда фосфорилирование не происходит. Эффект разобщения дыхания и фосфорилирования можно достичь обработкой растений определенными дыхательными ядами, например 2,4-динитрофенолом. При действии этого веществами стимулируется дыхание и подавляется окислительное фосфорилирование. Среди некоторой части ученых существует мнение, что разобщение дыхания и фосфорилирования — это не только нарушение нормального процесса, но и защита от неблагоприятных условий, в частности понижения температуры. Предполагают, что превращение энергии дыхания в тепло несколько повышает температуру тела растения и способствует лучшему переживанию охлаждения.