Виды жидкостной хроматографии.
Жидкостная хроматография, в свою очередь, разделяется на жидкостно-адсорбционную (разделение соединений происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности адсорбента), жидкостно-жидкостную, или распределительную (разделение осуществляется за счет различной растворимости в подвижной фазе - элюенте и неподвижной фазе, физически сорбированной или химически привитой к поверхности твердого адсорбента), ионообменную хроматографию, где разделение достигается за счет обратимого взаимодействия анализируемых ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента - ионита. Ионообменная хроматография наряду с другими областями ее использования играет большую роль в производстве антибиотиков: стрептомицина, тетрациклина, синтетического пенициллина.
В основу одной из разновидностей ЖХ - ион-парной (ИПХ) положены принципы классической экстракции ионных веществ из водной в органическую фазу в виде ионных пар. Для этого в подвижную фазу добавляется противоион, способный вступать в селективное комплексообразование с анализируемыми компонентами с образованием ионной пары. Основные преимущества такого варианта заключаются в том, что одновременно могут быть проанализированы вещества кислотного, основного и нейтрального характера.
6
При выборе условий разделения необходимо учитывать молекулярную массу компонентов образца, их полярность и природу сопутствующих соединений. Если молекулярная масса превышает 2000 у.е., то обычно обращаются к методу эксклюзионной, или гель-хроматографии. Во всех остальных случаях решение задачи разделения многокомпонентной смеси возможно в принципе осуществить методами адсорбционной или распределительной ЖХ в нормально- или обращенно-фазовом варианте (ОФ). Нормально-фазовый режим предпочтителен, если анализируемые вещества содержат различные функциональные группы. При этом имеют значение количество функциональных групп, способность анализируемых соединений к образованию водородных связей, строение (например, цис-трансизомерия). Если вещества обладают слабым сродством к подвижной фазе, то используют активные слои сорбента и слабо полярные растворители. К ОФ-хроматографии прибегают при разделении гомологов, сильно полярных веществ, анализ которых на полярных сорбентах неэффективен, а также соединений, сродство которых к полярной неподвижной фазе незначительно.
7
По оценкам авторитетных специалистов, 70% хроматографических анализов проводят методом ОФ ВЭЖХ; разработаны и внедрены сорбенты на основе силикагеля с химически привитыми алкильными радикалами. Чаще всего применяют сорбенты с С8- и С18-группами, стабильные в водных растворах в интервале рН 2-8. Этим объясняется их эффективное использование при анализе биологических объектов. Методом ОФ ВЭЖХ осуществляется определение важнейших нейромедиаторов (от лат. mediator - посредник; медиаторы передают информацию в живом организме, меняя ионную проницаемость наружных клеточных мембран) в плазме крови, спинномозговой жидкости, что имеет большое значение для диагностики различных заболеваний мозга (паркинсонизм, эпилепсия, шизофрения, болезнь Альцгеймера). Времена выхода компонентов, отсчитываемые от момента ввода пробы до регистрации вершины хроматографического пика, или, иначе, объемы подвижной фазы, затраченные на перенос через колонку каждого компонента, дают качественную характеристику анализируемых веществ (рис. 3). Сопоставление площадей (или высот) хроматографических пиков позволяет выполнять количественные определения.
Особое место в использовании методов жидкостной хроматографии в медицине занимают эксклюзионная, или гель-хроматография и аффинная, или биоспецифическая.
8