11. Транскрипция у прокариот. Особенности структуры рнк полимеразы.

Прокариоты не имеют ядерной мембраны, поэтому процессы транскрипции,

трансляции и мРНК деградации могут проходить одновременно.

• Прокариотической транскрипции характерно иметь полицистронные мРНК,

для одновременного синтеза нескольких белков.

• РНК-полимераза состоит из 5 полипептидов (холоэнзим), которые

собираются вместе каждый раз когда необходима транскрипция гена:

• α-субъединица (их две) – необходима для сборки полимераз на ДНК. связывает регуляторные последовательности ДНК и белки. У прокариот - одна.

• β – связывает рибонуклеозидтрифосфаты, построение полинуклеотидной цепи РНК

• β' – связывается с цепью ДНК ( β, β` - каталитические центры)

• ω - в учебнике написано, что функции не установлены

Пять перечисленных протомеров составляют основу фермента – кор (core). Комплекс α2β` служит для специфического взаимодействия с промоторами. После присоединения к кору еще одной субъединицы σ-фактора – образуется холофермент РНК-полимераза, способная узнавать промоторную область в оперонах бактерий и инициировать процесс транскрипции. σ-субъединицы различаются в зависимости от того, какую группу промоторов должна узнавать субъединица.

Промотор узнается РНК-полимеразой перед специфической транскрипцией.

Этапы:

1. Инициация. Сборка преинициационного комплекса: РНК-полимераза+ДНК-матрица. Сигма-фактор определяет специфичность связывания.

2. Элонгация. РНК-полимераза фосфорилируется, изменяет конформацию и начинает синтез

3. Терминация. Распознавание терминатора. Образование РНК-шпильки. Терминатор богат Т-последовательностями.

После инициации σ-субъединица отделяется от холофермента, элонгация происходит за счет кор-фермента (комплекс α2ββ`). После инициации к α2ββ` могут присоединяться ассоциированные факторы, которые диссоциируют после терминатора.

Факторы не являются необходимыми для ферментативной активности.

NusA - фактор элонгации, паузы РНК-полимеразы на участках ДНК, необходимых для сворачивания РНК во вторичную структуру. Необходимы для рРНК. Участвуют в регуляции терминации.

NusG - подавляет остановки РНК-полимеразы. Регулируют терминацию.

GreA, GreB - узнают ошибки (когда РНК-полимераза идет не в ту сторону), и способствуют гидролизу РНК-транскрипта РНК-полимеразой.

Mfd - узнает РНК-полимеразу, остановившуюся около тиминовых тимеров, способствует её диссоциации и привлекает белки репарации UvrABC к ДНК

12. Промоторы у прокариот.

Промотор - это участок ДНК, ответственный за связывание с РНК-полимеразой. Узнаваемая РНК-полимеразой последовательность. Ассиметрична, что указывает направление транскрипции. определяет матричную сеть.

Промоторы бактерий содержат несколько специфических элементов, необходимых для их узнавания. Наиболее консервативными являются -10 (TATAAT) и -35 (TTGACA) последовательности, которые расположены на расстоянии примерно 10 и 35 нуклеотидов левее старта транскрипции и узнаются районами 2.3/2.4 и 4.2 сигма-субъединицы, соответственно. Расстояние между -10 и -35 элементами у большинства промоторов составляет 17-18 нт (нуклеотидов). Промоторы с бoльшим (19 нт) или меньшим (16 нт) расстоянием узнаются РНКП с меньшей эффективностью и часто требуют для своего узнавания участия дополнительных факторов.

Нуклеотиды, расположенные до инициирующего кодона («вверх по течению») записываются со знаком «-», а со знаком «+» - все нуклеотиды, начиная с первого в инициирующем кодоне (стартовая точка).Направление, в котором продвигается процесс транскрипции, называется «вниз по течению».

Последовательность, обозначаемая «-35» (TTGACA), отвечает за узнавание промотора РНК-полимеразой, а последовательность «-10» (или бокс Прибнова) является тем участком, с которого начинается раскручивание двойной спирали ДНК. В состав этого бокса наиболее часто входят основания ТАТААТ. Такая последовательность оснований чаще всего встречается в промоторах прокариот, ее называют консенсусной.

Некоторые промоторы содержат дополнительный элемент - динуклеотид TG, - который расположен на один нуклеотид левее -10 элемента и узнается районом 2.5 сигма-субъединицы. Такие промоторы получили название промоторов с удлиненной -10 областью, для их узнавания не требуется -35 элемента. Наконец, некоторые сильные промоторы, в частности, промоторы рибосомальных РНК, содержат A/Т-богатую последовательность, расположенную на расстоянии 50-70 нт левее стартовой точки транскрипции, и получившую название UP-элемент. UP-элемент промоторов узнается С-концевым доменом альфа-субъединицы РНКП.

В состав ТАТА-бокса входят аденин и тимин, между которыми имеются только две водородные связи, что облегчает расплетание цепей ДНК в этом районе промотора. В случае замен пар оснований в указанных последовательностях промотора нарушается эффективность и правильное определение точки начала транскрипции, с которой фермент РНК-полимераза начинает синтез РНК. У прокариот наряду с промотором имеются и другие регуляторные участки: это активатор и оператор.

ТАТА-бокс, -35 region, UP-элемент

UP-элемент - АТ-богатая последовательность. С ней взаимодействует α-субъединица своими С-концевыми доменами. Стимулирует транскрипцию в отсутствие дополнительных факторов.

Стартовая точка - обычно пуриновое основание (чаще А, чем Г). Часто находится в середине блока САТ

Слева (против хода транскрипции) от стартовой точки находится ТАТА-бокс.

T₈₀A₉₅T₄₅A₆₀A₅₀T₉₆ (цифры - % встречаемости)

-35 region (TTGACA) - область узнавания. Узнается РНК-полимеразой, но не входит в область прочного связывания.

У слабых промоторов существенные отличия по ТАТА-боксу и -35 region

На всякий случай:

Терминация транскрипции может осуществляться по двум вариантам:

Rho-зависимая терминация

• контролируется Rho белком

• фактор Rho связывается с растущей цепью РНК

• в местах p-зависимой терминации транскрипции РНК- полимераза прекращает элонгацию

• белок Rho дестабилизирует водородные связи между матрицей ДНК и мРНК, высвобождая молекулу РНК

Rho-независимая терминация

• Контролируется последовательностью в ДНК-матрице

• РНК-полимераза доходит до CG- богатого участка

• Синтезированная молекула РНК формирует стебель-петлю, за которой расположено несколько урацилов, что приводит к отсоединению молекулы РНК от матрицы ДНК.