9. Механизм репарации неспаренных нуклеотидов. Роль метилирования.
Перед репликацией ДНК находится в метилированной форме, вновь синтезированная цепь - неметилирована
Новая цепь неметилированная - так узнается дочерняя цепь в только что синтезированной ДНК. В процессе репликации возникают ошибки.
С неправильным основанием связывается белок MutS (Mutation Search), с которым затем связываются белки MutL и MutH. Образуется репарационный комплекс с затратой 1 молекулы АТР.
Белок MutH разрезает неметилированную нить ДНК по сайту GATC, который может располагаться по любую сторону от неправильного основания.
Затем ДНК-хеликаза II (MutU=UvrD) расплетает надрезанную нить ДНК между надрезом и неспаренным основанием (включая его) и вытесняет ее из гетеродуплекса.
Экзонуклеаза I (если это 3'-конец) или экзонуклеаза VII (если это 5'-конец) удаляет вытесненную нить. Этот процесс нуждается в MutL и MutS. Вырезаются фрагменты
до 1000 п.н.
Затем образовавшаяся брешь застраивается ДНК-полимеразой III в присутствии SSB- белка.
Наконец, ДНК-лигаза восстанавливает фосфодиэфирную связь.
Эукариоты: Есть гомологи MutS и MutL. гомолога MutH не обнаружено.
Либо происходит эксцизионная репарация: гликозилаза->эндонуклеаза->ДНК-пол β
10. SOS-репарация
· Многие мутагены повреждают основания ДНК, что приводит к невозможности специфического спаривания оснований. В результате репликация блокируется.
· У про- и эукариотических организмов репликационные блоки обходятся с помощью встраивания неспецифических оснований.
· У E.coli этот процесс нуждается в индукции SOS-системы.
Синтез ДНК в обход повреждений, “ошибочный” путь репарации.
Сообщить об остановке репликации: RecA и LexA. Ключевая роль в SOS-индукции принадлежит белку RecA. Он связывается с однонитевой ДНК и образует ДНК-белковые филаменты, представляющие собой активную форму RecA*.
LexA ингибирует транскрипцию генов репарации.
RecA* является сигналом, запускающим индукцию SOS-регулона (более 40 генов), продукты которых необходимы для выживания клетки при массивных повреждениях ДНК.
В SOS-регулон входят гены umuD, umuC, dinB, продукты которых необходимы для репликации в обход повреждения.
Комплекс UmuD+UmuC = ДНК-полимераза V - Осуществляет репликацию через АП-сайты (участки, лишенные азотистых оснований - апуриновые или апиримидиновые), тимидиновые димеры и ряд других повреждений. Вставляет напротив повреждений случайные нуклеотиды.
Обходная репликация является неточной, склонной к ошибкам. В результате повышается частота мутаций.
SOS-репарация осущевствляется ДНК-полимеразами I, IV, V.
Обычно белки LexA связаны с операторами SOS-сайтов. Сигналом для активации служит образование одноцепочечной ДНК, где ДНК-полимераза блокирована. Вокруг одноцепочесной ДНК RecA формирует филаменты и активируется.
Активированная форма RecA взаимодействует с LexA, отделяя его от операторов SOS-сайтов, что приводит к синтезу продуктов генов SOS-репарации.
Операторы разных генов SOS-репарации обладают разным сродством к LexA. гены с малым сродством эксперссируются первыми. В них закодированны ферменты с минимальным процентом ошибки. Чем сильнее повреждения, тем больше RecA активируется, тем больше LexA отсоединяется от оперонов, и тем более неприхотливые ферменты (но с большим процентом ошибок) будут синтезироваться.